Активность субстанции инсулина определяют на кроликах

Активность субстанции инсулина определяют на кроликах

Содержимое (Table of Contents)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Биологические испытания ОФС.1.2.4.0001.15

инсулина Взамен ОФС 42-0009-02

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на лекарственные средства, стандартные образцы и аналоги инсулина.

Биологические методы испытания инсулина основаны на сопоставлении гипогликемического (сахаропонижающего) действия испытуемого препарата (ИП) с гипогликемическим действием стандартного образца (СО) инсулина или соответствующих СО его аналогов. Биологические методы используют для определения следующих показателей качества:

— биологическая активность (раздел 1);

— пролонгированное действие (раздел 3).

Биологические испытания инсулина и его аналогов отражают их терапевтическое действие. Показатель «Биологическая активность» позволяет количественно определять содержание гипогликемического действующего вещества. Данное определение может проводиться для аттестации СО инсулина при отработке новых производственных технологий для оценки качества и в ходе проверки стабильности в процессе установления срока годности (раздел 1).

Показатель «Биоидентичность» используется для подтверждения подлинности лекарственных средств инсулина или его аналогов по наличию у них гипогликемического действия (раздел 2).

«Пролонгированное действие» – показатель качества лекарственных препаратов инсулина удлиненного действия и их аналогов, который характеризует продолжительность гипогликемического эффекта во времени. Данный показатель является обязательным для всех пролонгированных препаратов и аналогов инсулина (раздел 3).

СО для биологических испытаний представляет собой активное вещество (инсулин человека, инсулин свиной, инсулин крупного рогатого скота, аналоги инсулина), обладающее гипогликемическим действием с указанием точной величины биологической активности, выраженной в международных единицах действия (МЕ) в пересчете на сухое вещество.

Допускается многократное использование животных для биологических испытаний лекарственных средств и аналогов инсулина: кроликов – не ранее чем через 2 недели, мышей не ранее чем через 1 неделю после проведения предыдущего испытания.

1.Приготовление основных растворов СО и ИП. Для проведения биологических испытаний готовят основной раствор СО инсулина или его аналога.

Точную навеску СО инсулина растворяют в соответствующем объеме растворителя для получения концентрации 100 МЕ/мл. В качестве растворителя применяют 0,9 % раствор натрия хлорида для инъекций, подкисленный 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты до рН 2,5–3,5. В фармакопейных статьях на аналоги инсулина могут быть указаны другие растворители.

Основной раствор следует хранить при температуре от 2 до 8 °С. Замораживание не допускается. Можно использовать только прозрачный раствор.

При определении биологической активности субстанции инсулина основной раствор ИП готовят таким же образом, что и основной раствор СО. Разведение субстанции проводят, исходя из величины биологической активности инсулина с учетом фактического содержания влаги.

  1. Приготовление рабочих растворов СО и ИП. Рабочие растворы СО и ИП готовят из основных растворов непосредственно перед испытанием, добавляя соответствующие объемы растворителя до получения требуемых концентраций. В качестве растворителя применяют 0,9 %раствор натрия хлорида для инъекций, подкисленный 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты до рН 2,5 – 3,5.

При определении биологической активности лекарственных препаратов инсулина пролонгированного действия, представляющих собой суспензии, ИП осторожно взбалтывают и отбирают 1,0 мл, к которому для полного растворения суспензии добавляют 0,2 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты. Таким образом, если исходная концентрация ИП равна100 МЕ/мл, то полученный раствор ИП будет иметь концентрацию 83,3 МЕ/мл. В дальнейшем полученный раствор используют для приготовления рабочих растворов ИП.

Основные и рабочие растворы аналогов инсулина готовят, как указано в фармакопейных статьях.

Биологическую активность субстанций инсулина, его лекарственных форм и аналогов определяют одним из 2 методов по снижению концентрации глюкозы в крови:

Метод определения биологической активности инсулина и его аналогов по снижению концентрации глюкозы в крови кроликов (метод А)

Испытания проводят на кроликах породы Шиншилла, массой тела от 2,5 кг. В опыте используют не менее 24 кроликов. Животных содержат на стандартном рационе с соблюдением санитарных правил. За 18 – 20 ч до эксперимента животных лишают корма, а перед началом испытания убирают воду.

Непосредственно перед экспериментом из основных растворов СО и ИП готовят по 2 рабочих раствора (см. Общие положения примечания 1 и 2). В зависимости от чувствительности животных рекомендуемые концентрации рабочих растворов СО для лекарственных средств инсулина – 1,0 и 2,0 МЕ/мл, а для аналогов инсулина – в диапазоне 1,0 – 4,0 МЕ/мл.

Животных распределяют на 4 равные группы способом случайного отбора. Каждая группа животных получает рабочие растворы СО и ИП в порядке, предусмотренном схемой двойного перекреста (табл.). Первой и второй группе животных подкожно вводят рабочие растворы СО в объеме 0,5 мл на животное (малая – s1 и большая – s2 дозы СО), а третьей и четвертой группе – такой же объем рабочих растворов ИП (малая – u1 и большая – u2 дозы). Вторую постановку теста («перекрест») проводят не менее чем через неделю после первой.

Таблица – Схема двойного перекреста (последовательность введения рабочих растворов животным)

Испытание Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4
I постановка (день I) s1 s2 u1 u2
II постановка (день II) u2 u1 s2 s1

Взятие крови осуществляют трижды: непосредственно перед введением испытуемых растворов и через 1 и 2,5 ч после инъекции препарата. Примерно 50 мкл крови из краевой вены уха собирают в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл, содержащую 10 мкл раствора гепарина (5000 МЕ/мл).

Концентрацию глюкозы в крови животных определяют согласно разделу 4. Устанавливают среднюю величину, на которую снижается концентрация глюкозы в крови через 1 и 2,5 ч после введения рабочего раствора СО и ИП инсулина у каждого животного и выражают ее в процентах по отношению к исходной.

Из опыта исключают животных, которые отвечают судорогами на введение инсулина и тех, у которых снижение концентрации глюкозы в крови составляет менее 15 % по отношению к исходному уровню.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу 3.6 «Обработка результатов двойного перекреста (на примере биологической активности инсулина методом А и В)» ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Метод определения биологической активности инсулина по снижению концентрации глюкозы в крови мышей (метод B)

В опыт берут не менее 40 мышей-самок массой тела 20 – 28 г. Животных распределяют на 4 равные группы способом случайного отбора и метят (нумеруют) по порядку каждую особь внутри группы. Мышей содержат на стандартном рационе вивария с соблюдением санитарных правил. До и во время опыта животным должен быть обеспечен свободный доступ к корму и воде.

Непосредственно перед экспериментом из основных растворов СО и ИП готовят по 2 рабочих раствора (см. Общие положения, примечания 1, 2). Концентрация рабочих растворов должна находиться в диапазоне 0,06 – 1,2 МЕ/мл. Для аналогов инсулина возможно применение других концентраций. Большая доза рабочих растворов СО и ИП должна превышать малую не менее чем в 2 раза.

Согласно схеме двойного перекреста (табл.), мышам первой и второй группы подкожно в холку вводят рабочие растворы СО, а третьей и четвертой – такие же объемы рабочих растворов ИП по 0,1 мл/10 г массы тела животного. Рабочие растворы вводят каждому животному последовательно, в соответствии с нумерацией, через каждые 15 – 20 с. Так, например, на введение раствора группе из 12 животных необходимо 3 – 4 мин. Интервал между введениями рабочих растворов каждой группе животных должен составлять 1 – 2 мин.

После инъекции инсулина через (40 ± 1) мин последовательно в соответствии с номером каждого животного внутри группы из орбитального венозного синуса глаза осуществляют взятие около 50 мкл крови с помощью стерильного гепаринизированного капилляра. Необходимо соблюдать те же временные интервалы, что и при введении растворов. Пробы крови помещают в микроцентрифужные пробирки объемом 0,5 мл. Определение концентрации глюкозы в крови животных проводят согласно разделу 4.

Вторую постановку эксперимента (перекрест) проводят через 24 ч после первой.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу 3.6 «Обработка результатов двойного перекреста (на примере биологической активности инсулина методом А и В)», описанному в ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Если в фармакопейной статье даны иные указания, то следуют им.

Определение биоидентичности представляет собой вариант метода определения биологической активности инсулина и его аналогов, подтверждающий подлинность препарата с использованием минимального количества животных. Испытание проводят аналогично разделу 1 (метод А или B) со следующими изменениями:

  1. В опыт берут 8 кроликов по 2 в каждой группе (метод А) или 20 мышей по 5 в каждой группе (метод B).
  2. Не вычисляют доверительные границы величины биологической активности, так как используемое количество животных не позволяет провести статистическую обработку результатов. Метод является полуколичественным.

Препарат считают прошедшим испытание, если его биологическая активность составляет не менее 56 % от ожидаемой.

Если в фармакопейной статье даны иные указания, то следуют им.

Используют кроликов одного пола массой не менее 2,5 кг, которых содержат на стандартном рационе вивария. В опыт берут не менее 18 животных, которых способом случайного отбора распределяют на 2 равные группы. За 18–20 ч до исследования кроликов лишают корма, а перед опытом убирают воду.

Животным подкожно вводят одинаковую дозу основного раствора СО или неразведенного ИП (см. Общие положения примечание 1). Рекомендуемый диапазон доз составляет 0,5 – 0,8 МЕ/кг. Взятие крови проводят непосредственно перед инъекцией, а также через 1,5; 3,0; 4,5 и 6,0 ч после нее. Процедура взятия крови описана в разделе 1 (метод А). Определение концентрации глюкозы в крови животных проводят согласно разделу 4.

За контрольную временную точку принимают момент времени, при котором через 4,5 – 6 ч после инъекции средняя концентрация глюкозы в крови животных, получивших основной раствор СО, приблизится к 100 ± 15 % от исходного уровня. В этой точке для каждого кролика рассчитывают индивидуальную концентрацию глюкозы в крови в процентах относительно исходного уровня для данного животного.

Испытуемый препарат считают прошедшим испытание, если в контрольной временной точке у животных, получивших ИП, средняя относительная концентрация глюкозы в крови, рассчитанная из индивидуальных концентраций, достоверно ниже, чем у животных, получивших основной раствор СО. Достоверность различия проверяют с помощью критерия Стьюдента при доверительной вероятности Р = 0,95.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу 3.8 «Обработка результатов испытания на пролонгированное (удлиненное) действие лекарственных препаратов инсулина и его аналогов» ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Для определения концентрации глюкозы в плазме кроликов и мышей рекомендуется применять глюкозооксидазный метод с использованием многоканального фотоэлектроколориметра.

После каждого взятия крови пробы центрифугируют в течение 5 мин при температуре 5 о С и при величине относительного центробежного ускорения (ОЦУ), равной 1500 g (см. Примечание). От каждой пробы отбирают по 10 мкл плазмы и переносят в микрокювету плоскодонного 96-луночного планшета. Планшет с пробами можно хранить при температуре от 6 до 8 0 Сдо окончания испытания.

Перед измерением в каждую микрокювету с плазмой добавляют по 240 мкл реактива готового энзимо-хромогенного набора, например «GLUCOSE Liquicolor» или аналогичного. Планшеты инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение не менее 20 мин.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 492 нм.

В качестве раствора сравнения используют стандартный раствор глюкозы с концентрацией 5,55 ммоль/л (100 мг %), входящий в состав готового энзимо-хромогенного набора.

Концентрацию глюкозы (с) в крови рассчитывают по формуле:

где A – оптическая плотность пробы;

A0 – оптическая плотность глюкозы в растворе сравнения.

Примечание. Величина ОЦУ зависит от радиуса ротора центрифуги и скорости его вращения. Скорость вращения ν (об/мин) для обеспечения необходимой величины ОЦУ (в данном случае 1500 g) вычисляют по следующей формуле:

Активность испытуемого препарата инсулина определяют путем

сопоставления его гипогликемического (сахаропонижающего) действия

с гипогликемическим действием стандартного образца инсулина.

Стандартный образец и единица действия инсулина

Стандартный образец инсулина представляет собой препарат

высокоочищенного инсулина, активность которого определена путем

многократного сопоставления с активностью международного стандарта

и составляет не менее 25 ЕД в 1 мг. За единицу действия (ЕД)

принимают специфическую активность количества массы стандартного

образца, эквивалентного по биологическому действию 1 международной

Примечание. Приготовление растворов стандартного образца и

испытуемого препарата инсулина. Точную навеску стандартного

образца инсулина растворяют в растворе хлористоводородной кислоты

(0,003 моль/л) с рН 2,7-3,0, содержащем консервант в такой же

концентрации, как испытуемый препарат.

Срок годности основного раствора стандартного образца инсулина

4 мес при температуре 4 град. С.

Перед опытом основной раствор стандартного образца инсулина

разводят раствором хлористоводородной кислоты (0,003 моль/л) до

концентрации 1 ЕД в 1 мл. Испытуемый препарат инсулина разводят

этим же раствором хлористоводородной кислоты до концентрации 1 ЕД

в 1 мл, исходя из его предполагаемой активности.

Метод определения биологической активности

Определение биологической активности инсулина проводят на

здоровых кроликах массой 2,5-3,5 кг. Животных массой 1,8-2,3 кг

предварительно не менее 14 сут содержат в условиях вивария, где

они получают овес, сено или свежую траву, корнеплоды,

комбинированный корм и воду. По истечении этого срока определяют

чувствительность кроликов к инсулину. Для этого кроликам дважды с

интервалом 7-8 сут после 18 ч голодания вводят подкожно раствор

стандартного образца инсулина из расчета 0,5 ЕД на 1 кг массы тела

животного и определяют величину снижения концентрации сахара в

крови в процентах. Кровь для исследования берут из краевой вены

уха животных до введения инсулина и через 1,5 и 2,5 ч после его

введения (для расчета берут среднюю концентрацию сахара в крови из

двух определений после введения инсулина). Кровь берут в условиях,

не допускающих чрезмерного волнения кроликов. Из опытов исключают

животных с исходной концентрацией сахара в крови ниже и выше

пределов, установленных для используемого метода определения

содержания сахара в крови (ниже 75 мг % и выше 120 мг % для

феррицианидного метода, ниже 52 мг % и выше 94 мг % для

глюкозооксидазного метода), а также тех животных, которые

реагируют на введение инсулина судорогами или у которых снижение

концентрации сахара в крови составляет менее 15% по отношению к

исходной концентрации. Определение биологической активности

инсулина проводят не ранее чем через 7-8 сут после испытания на

Отобранных для опытов кроликов лишают корма (но не воды) на 18

ч, предшествующих введению инсулина. Животных распределяют на две

группы способом случайного выбора (в каждой группе должно быть не

менее 9 кроликов). Непосредственно перед введением инсулина

кроликов взвешивают, и определяют исходную концентрацию сахара в

крови. Кроликам одной группы вводят подкожно по 0,5 ЕД

стандартного образца инсулина (S) на 1 кг массы тела, кроликам

другой группы — такую же дозу испытуемого препарата инсулина (Т).

Через 1,5 и 2,5 ч после введения инсулина у животных снова

определяют концентрацию сахара в крови.

Для каждого кролика рассчитывают снижение концентрации сахара

(X) в крови в процентах по формуле:

где а — исходная концентрация сахара в крови в миллиграмм —

процентах; b — средняя концентрация сахара в крови в миллиграмм —

процентах из двух определений, проведенных через 1,5 и 2,5 ч после

Как и при испытании кроликов на чувствительность к инсулину,

при расчетах не учитывают животных с исходной концентрацией сахара

в крови ниже и выше пределов, установленных для используемого

метода, а также реагирующих на указанную дозу инсулина судорогами

или дающих снижение концентрации сахара в крови менее 15 % по

отношению к исходной концентрации.

Через 3-5 сут на этих же кроликах проводят повторное испытание

с той разницей, что животным из группы, получавшей стандартный

образец инсулина (S), вводят испытуемый препарат инсулина (Т), а

животным группы, получавшей (Т), вводят (S).

Рассчитывают среднюю величину снижения концентрации сахара в

крови на стандартный образец (%S) и на испытуемый препарат (%Т) по

данным всего опыта. Отношение %T / %S выражает относительную

активность (R) испытуемого препарата (Т). Для выражения активности

испытуемого препарата (Т) в ЕД его предполагаемую активность (А)

Пример: при определении биологической активности инсулина для

инъекций с предполагаемой активностью 40 ЕД в 1 мл получили

следующие величины снижения концентрации сахара в крови в

Первая часть испытания Вторая часть испытания

1) высокой лабильности целевого продукта (лекарственного вещества)

2) использования целевого продукта только в инъекционной форме

3) внутриклеточной локализации целевого продукта

4) высокой гидрофильности целевого продукта

177. ИММОБИЛИЗАЦИЯ ЦЕЛЫХ КЛЕТОК ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЕСООБРАЗНА В СЛУЧАЕ ЕСЛИ ЦЕЛЕВОЙ ПРОДУКТ

3) локализован внутри клетки

4) им является биомасса клеток

178. ТЕХНОЛОГИЯ, ОСНОВАННАЯ НА ИММОБИЛИЗАЦИИ БИООБЪЕКТА, УМЕНЬШАЕТ НАЛИЧИЕ В ЛЕКАРСТВЕННОМ ПРЕПАРАТЕ СЛЕДУЮЩИХ ПРИМЕСЕЙ

4) следы органических растворителей

ИММОБИЛИЗОВАННЫХ БИООБЪЕКТАХ, ПЕРЕД ТРАДИЦИОННЫМ ОБУСЛОВЛЕНО

1) меньшими затратами труда

3) многократным использованием биообъекта

4) ускорением производственного процесса

181. АКТИВИРОВАНИЕ НЕРАСТВОРИМОГО НОСИТЕЛЯ НЕОБХОДИМО

1) для усиления включения фермента в гель

2) для повышения сорбции фермента

3) для повышения активности фермента

4) для образования ковалентной связи

182. ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗА КАТАЛИЗИРУЕТ

1) расщепление бета-лактамного кольца

2) расщепление тиазолидинового кольца

3) отщепление бокового радикала при С 6

4) деметилирование тиазолидинового кольца

183. УДАЛЕНИЕ ЛАКТОЗЫ ИЗ МОЛОКА ОСУЩЕСТВЛЯЮТ С ПОМОЩЬЮ ИММОБИЛИЗИРОВАННОГО ФЕРМЕНТА

184. АМИНОАЦЕЛАЗА ИСПОЛЬЗУЕТСЯ

1) при получении полусинтетических пенициллинов

2) при разделении рацематной смеси аминокислот

3) при получении безлактозного молока

4) при получении фруктозных сиропов

185. БЕТА-ГАЛАКТОЗИДАЗА ИСПОЛЬЗУЕТСЯ

1) при получении полусинтетических пенициллинов

2) при разделении рацематной смеси аминокислот

3) при получении безлактозного молока

4) при получении фруктозных сиропов

186. АЛЬФА-АМИЛАЗА В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОМ ПРОИЗВОДСТВЕ ИСПОЛЬЗУЕТСЯ С ЦЕЛЬЮ

3) превращения глюкозы во фруктозу

4) получения безлактозного молока

187. КОГДА НЕРАЦИОНАЛЬНА ИММОБИЛИЗАЦИЯ ЦЕЛЫХ КЛЕТОК ПРОДУЦЕНТОВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ В

1) высокой лабильности целевого продукта

2) использования целевого продукта только в инъекционной форме

3) высокой гидрофильности целевого продукта

4) внутриклеточной локализации целевого продукта

188. В КАКОМ СЛУЧАЕ ИММОБИЛИЗАЦИЯ ЦЕЛЫХ КЛЕТОК ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЕСООБРАЗНА ЕСЛИ ЦЕЛЕВОЙ ПРОДУКТ

2) локализован внутри клетки

3) им является биомасса клеток

190. С ПОМОЩЬЮ КАКОГО ИММОБИЛИЗИРОВАННОГО ФЕРМЕНТА ПРОИСХОДИТ УДАЛЕНИЕ ЛАКТОЗЫ ИЗ МОЛОКА

191. С КАКОЙ ЦЕЛЬЮ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОМ ПРОИЗВОДСТВЕ ИСПОЛЬЗУЕТСЯ АЛЬФА-АМИЛАЗА

2) превращения глюкозы во фруктозу

4) получения безлактозного молока

192. РОЛЬ ВЕКТОРА В ТЕХНОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК ВЫПОЛНЯЮТ

193. ПОНЯТИЕ «ЛИПКИЕ КОНЦЫ» ПРИМЕНИТЕЛЬНО К ТЕХНОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК ОТРАЖАЕТ

1) комплементарность нуклеотидных последовательностей

2) взаимодействие нуклеиновых кислот и гистонов

3) реагирование друг с другом SH — групп с образованием дисульфидных связей

4) гидрофобное взаимодействие липидов

194. СУБСТРАТАМИ РЕСТРИКТАЗ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ

ТЕХНОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК ЯВЛЯЮТСЯ

195. МИШЕНЬЮ ДЛЯ ФИЗИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ МУТАГЕНОВ В КЛЕТКЕ БИООБЪЕКТОВ ЯВЛЯЕТСЯ

1) дезоксирибонуклеиновая кислота

196. РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКОВЫЕ ГОРМОНЫ И ФАКТОРЫ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ИМЕЮТ, ПО СРАВНЕНИЮ С ВЫДЕЛЯЕМЫМИ ИЗ ЖИВОТНОГО СЫРЬЯ, ПРЕИМУЩЕСТВА ЗА СЧЕТ

1) большей биологической активности

3) большей рентабельности и производства

3) 2-х дисульфидных мостиков

4) 3-х дисульфидных мостиков

198. ДЛИТЕЛЬНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТОВ ИНСУЛИНА ЗАВИСИТ ОТ

1) количества ионов инсулина

2) размеров кристаллов инсулина

3) наличие аморфного инсулина

4) количества консерванта нипагина и фенола

199 РОЛЬ ВЕКТОРА В ТЕХНОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК ВЫПОЛНЯЮТ

200. ИНСУЛИН ОБРАЗУЕТ СТОЙКИЕ КОМПЛЕКСЫ С ИОНАМИ

201. ПРОИНСУЛИН — ЭТО БЕЛОК, КОТОРЫЙ СОСТОИТ ИЗ

2) из 84-х аминокислотных остатков

3) из инсулина и инсулиноподобных белков

202. ПРЕИМУЩЕСТВОМ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ИНСУЛИНА ЯВЛЯЕТСЯ

203. МОЛЕКУЛА ИНСУЛИНА СВИНЕЙ ОТЛИЧАЕТСЯ ОТ МОЛЕКУЛЫ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНСУЛИНА СЛЕДУЮЩИМИ ПАРАМЕТРАМИ

3) наличием дисульфидных мостиков

4) количеством полипептидных цепей

204. ЧТО ЯВЛЯЕТСЯ СУБСТРАТАМИ РЕСТРИКТАЗ (В ТЕХНОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК)

205. ЗА СЧЕТ ЧЕГО ИМЕЮТ ПРЕИМУЩЕСТВО РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКОВЫЕ ГОРМОНЫ И ФАКТОРЫ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПО СРАВНЕНИЮ С ВЫДЕЛЯЕМЫМИ ИЗ ЖИВОТНОГО СЫРЬЯ

2) большей биологической активности

4) большей рентабельности и производства

206. ДЛИТЕЛЬНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТОВ ИНСУЛИНА ЗАВИСИТ ОТ

1) количества ионов инсулина

2) наличие аморфного инсулина

3) размеров кристаллов инсулина

4) количества консерванта нипагина и фенола

207. ЧТО ОТРАЖАЕТ ПОНЯТИЕ «ЛИПКИЕ КОНЦЫ» ПРИМЕНИТЕЛЬНО К ТЕХНОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК

1) взаимодействие нуклеиновых кислот и гистонов

2) реагирование друг с другом SH — групп с образованием дисульфидных связей

3) комплементарность нуклеотидных последовательностей

4) гидрофобное взаимодействие липидов

208. ЧТО ЯВЛЯЕТСЯ МИШЕНЬЮ ДЛЯ ФИЗИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ МУТАГЕНОВ В КЛЕТКЕ БИООБЪЕКТОВ

3) дезоксирибонуклеиновая кислота

209. АКТИВНОСТЬ СУБСТАНЦИИ ИНСУЛИНА ОПРЕДЕЛЯЮТ

210. ЧЕМ ОТЛИЧАЕТСЯ МОЛЕКУЛА ИНСУЛИНА СВИНЕЙ ОТ МОЛЕКУЛЫ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНСУЛИНА

2) наличием дисульфидных мостиков

211. МОНОКОМПОНЕНТНЫЙ ИНСУЛИН ПОЛУЧАЮТ МЕТОДОМ

2) ионообменной хроматографии

3) гидрофобной хроматографии

212. МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ ГЕНА ИНСУЛИНА

2) ферментативный на основе мРНК

3) выделение из генома рестриктазой

213. ИНСУЛИН СТАНДАРТИЗИРУЮТ ПО

2) гипогликемическому эффекту

3) повышению артериального давления

4) гипергликемическому эффекту

214. МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ ГЕНА СОМАТОТРОПИНА

2) ферментативный на основе мРНК

3) выделение из генома рестриктазой

215. АКТИВНОСТЬ СОМАТОТРОПИНА ОПРЕДЕЛЯЮТ

216. ОСНОВНОЕ ПРЕИМУЩЕСТВО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ ПО СРАВНЕНИЮ С БАКТЕРИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ

1) возможность поверхностного культивирования

2) способность осуществлять модификацию белков

4) устойчивость к вирусной инфекции

217. РОЛЬ ВЕКТОРА В ТЕХНОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК ВЫПОЛНЯЮТ

218. МОНОПИКОВЫЙ ИНСУЛИН СОДЕРЖИТ НЕЗНАЧИТЕЛЬНОЕ КОЛИЧЕСТВО

1) проинсулина и инсулиноподобных белков

2) инсулиноподобных белков

3) белки с молекулярной массой 15000 в количестве 2-5%

4) белки с молекулярной массой от 9000 до 12000 в количестве 4-8%

219. В СОСТАВ АКТИВНОГО ИЛА ВХОДЯТ

220. КИШЕЧНАЯ ПАЛОЧКА КАК РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОДУЦЕНТ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНСУЛИНА ПРОДУЦИРУЕТ

1) человеческий инсулин с правильной укладкой дисульфидных мостиков

2) проинсулин с правильной укладкой дисульфидных мостиков

3) отдельно цепи А и В инсулина

4) продуцирование внеклеточных метаболитов

221. ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ФИРМЫ «ELI LILLY» ОСНОВАНА НА ЭКСПРЕССИИ ГЕНА

1) в клетки кишечной палочки

2) в клетки пекарских дрожжей

3) в культуру клеток растений

222. АКТРАФАН НМ ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ

2) препарат рекомбинантного человеческого инсулина двухфазного действия, произведенный по технологии фирмы Novo

3) препарат рекомбинантного человеческого инсулина двухфазного действия, произведенный по технологии фирмы Eli lilly

4) препарат рекомбинантного человеческого инсулина ультракороткого действия, произведенный по технологии фирмы Novo

223. ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ФИРМЫ «NOVO NORDISK» (ДАНИЯ) ОСНОВАНА НА ЭКСПРЕСИИ ГЕНА

1) в клетки кишечной палочки

2) в клетки пекарских дрожжей

3) в культуру клеток растений

4) в культу клеток животных

224. ЧТО ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ АКТРАФАН НМ

2) препарат рекомбинантного человеческого инсулина двухфазного действия, произведенный по технологии фирмы Eli lilly

3) препарат рекомбинантного человеческого инсулина ультракороткого действия, произведенный по технологии фирмы Novo

4) препарат рекомбинантного человеческого инсулина двухфазного действия, произведенный по технологии фирмы Novo

225. ЧТО СОДЕРЖИТ МОНОПИКОВЫЙ ИНСУЛИН В НЕЗНАЧИТЕЛЬНОМ КОЛИЧЕСТВЕ

1) инсулиноподобных белков

2) белки с молекулярной массой 15000 в количестве 2-5%

3) проинсулина и инсулиноподобных белков

4) белки с молекулярной массой от 9000 до 12000 в количестве 4-8%

226. ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ФИРМЫ «ELI LILLY» ОСНОВАНА НА ЭКСПРЕССИИ ГЕНА

1) в клетки кишечной палочки

2) в клетки пекарских дрожжей

3) в культуру клеток растений

4) в культу клеток животных

227. ПРИ ОЧИСТКЕ СТОКОВ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ ПРИМЕНЯЮТ АКТИВНЫЙ ИЛ — ЭТО

1) природный комплекс микроорганизмов

4) смесь микроорганизмов, полученных генноинженерными методами

228. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА СТОЧНЫХ ВОД ОСНОВАНА

1) на способности микроорганизмов на минерализации органических веществ

2) на химическом окислении органических веществ

3) на сжигании органических веществ в токе кислорода

4) на окисление органических веществ под действием хлора

229. АППАРАТЫ, В КОТОРЫХ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ ДЕСТРУКЦИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ СТОЧНЫХ ВОД, НАЗЫВАЕТСЯ

230. АКТИВНЫЙ ИЛ, ПРИМЕНЯЕМЫЙ ПРИ ОЧИСТКЕ СТОКОВ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ — ЭТО

3) смесь микроорганизмов, полученных генноинженерными методами

4) природный комплекс микроорганизмов

231. КАК НАЗЫВАЮТСЯ АППАРАТЫ, В КОТОРЫХ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ ДЕСТРУКЦИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ СТОЧНЫХ ВОД

232. ПРИ ОЧИСТКЕ ПРОМЫШЛЕННЫХ СТОКОВ В «ЧАСЫ ПИК» ПРИМЕНЯЮТ ШТАММЫ-ДЕСТРУКТАТОРЫ

1) природные микроорганизмы

2) постоянные компоненты активного ила

3) стабильные генно-инженерные штаммы

4) не стабильные генно-инженерные штаммы

233. В СОСТАВ АКТИВНОГО ИЛА ВХОДЯТ

234. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА СТОЧНЫХ ВОД ОСНОВАНА

1) на химическом окислении органических веществ

2) на способности микроорганизмов на минерализации органических веществ

3) на сжигании органических веществ в токе кислорода

4) на окисление органических веществ под действием хлора

235. ОКОНЧАТЕЛЬНОЙ ОЧИСТКОЙ ИНСУЛИНА В ПРОМЫШЛЕННОМ ПРОИЗВОДСТВЕ ЯВЛЯЕТСЯ ОПЕРАЦИЯ

1) ионообменной хроматографии

2) кристаллизацией в присутствии солей цинка

3) кристаллизацией в присутствии ионов натрия

236. E. СOLI В КАЧЕСТВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ПРОДУЦЕНТА ИНСУЛИНА ИСПОЛЬЗУЮТ БЛАГОДАРЯ

2) способности к сплайсингу

3) способности образовывать дисульфидные связи

4) способности депонировать цепи А и В инсулина внутри клеток

237. В МОЛЕКУЛЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНСУЛИНА, В ОТЛИЧИИ ОТ СВИНОГО, В 30-М ПОЛОЖЕНИИ Β-ЦЕПИ НАХОДИТСЯ

Содержимое (Table of Contents)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Биологические испытания ОФС.1.2.4.0001.15

инсулина Взамен ОФС 42-0009-02

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на лекарственные средства, стандартные образцы и аналоги инсулина.

Биологические методы испытания инсулина основаны на сопоставлении гипогликемического (сахаропонижающего) действия испытуемого препарата (ИП) с гипогликемическим действием стандартного образца (СО) инсулина или соответствующих СО его аналогов. Биологические методы используют для определения следующих показателей качества:

– биологическая активность (раздел 1);

– пролонгированное действие (раздел 3).

Биологические испытания инсулина и его аналогов отражают их терапевтическое действие. Показатель «Биологическая активность» позволяет количественно определять содержание гипогликемического действующего вещества. Данное определение может проводиться для аттестации СО инсулина при отработке новых производственных технологий для оценки качества и в ходе проверки стабильности в процессе установления срока годности (раздел 1).

Показатель «Биоидентичность» используется для подтверждения подлинности лекарственных средств инсулина или его аналогов по наличию у них гипогликемического действия (раздел 2).

«Пролонгированное действие» – показатель качества лекарственных препаратов инсулина удлиненного действия и их аналогов, который характеризует продолжительность гипогликемического эффекта во времени. Данный показатель является обязательным для всех пролонгированных препаратов и аналогов инсулина (раздел 3).

СО для биологических испытаний представляет собой активное вещество (инсулин человека, инсулин свиной, инсулин крупного рогатого скота, аналоги инсулина), обладающее гипогликемическим действием с указанием точной величины биологической активности, выраженной в международных единицах действия (МЕ) в пересчете на сухое вещество.

Допускается многократное использование животных для биологических испытаний лекарственных средств и аналогов инсулина: кроликов – не ранее чем через 2 недели, мышей не ранее чем через 1 неделю после проведения предыдущего испытания.

1.Приготовление основных растворов СО и ИП. Для проведения биологических испытаний готовят основной раствор СО инсулина или его аналога.

Точную навеску СО инсулина растворяют в соответствующем объеме растворителя для получения концентрации 100 МЕ/мл. В качестве растворителя применяют 0,9 % раствор натрия хлорида для инъекций, подкисленный 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты до рН 2,5–3,5. В фармакопейных статьях на аналоги инсулина могут быть указаны другие растворители.

Основной раствор следует хранить при температуре от 2 до 8 °С. Замораживание не допускается. Можно использовать только прозрачный раствор.

При определении биологической активности субстанции инсулина основной раствор ИП готовят таким же образом, что и основной раствор СО. Разведение субстанции проводят, исходя из величины биологической активности инсулина с учетом фактического содержания влаги.

  1. Приготовление рабочих растворов СО и ИП. Рабочие растворы СО и ИП готовят из основных растворов непосредственно перед испытанием, добавляя соответствующие объемы растворителя до получения требуемых концентраций. В качестве растворителя применяют 0,9 %раствор натрия хлорида для инъекций, подкисленный 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты до рН 2,5 – 3,5.

При определении биологической активности лекарственных препаратов инсулина пролонгированного действия, представляющих собой суспензии, ИП осторожно взбалтывают и отбирают 1,0 мл, к которому для полного растворения суспензии добавляют 0,2 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты. Таким образом, если исходная концентрация ИП равна100 МЕ/мл, то полученный раствор ИП будет иметь концентрацию 83,3 МЕ/мл. В дальнейшем полученный раствор используют для приготовления рабочих растворов ИП.

Основные и рабочие растворы аналогов инсулина готовят, как указано в фармакопейных статьях.

Биологическую активность субстанций инсулина, его лекарственных форм и аналогов определяют одним из 2 методов по снижению концентрации глюкозы в крови:

Метод определения биологической активности инсулина и его аналогов по снижению концентрации глюкозы в крови кроликов (метод А)

Испытания проводят на кроликах породы Шиншилла, массой тела от 2,5 кг. В опыте используют не менее 24 кроликов. Животных содержат на стандартном рационе с соблюдением санитарных правил. За 18 – 20 ч до эксперимента животных лишают корма, а перед началом испытания убирают воду.

Непосредственно перед экспериментом из основных растворов СО и ИП готовят по 2 рабочих раствора (см. Общие положения примечания 1 и 2). В зависимости от чувствительности животных рекомендуемые концентрации рабочих растворов СО для лекарственных средств инсулина – 1,0 и 2,0 МЕ/мл, а для аналогов инсулина – в диапазоне 1,0 – 4,0 МЕ/мл.

Животных распределяют на 4 равные группы способом случайного отбора. Каждая группа животных получает рабочие растворы СО и ИП в порядке, предусмотренном схемой двойного перекреста (табл.). Первой и второй группе животных подкожно вводят рабочие растворы СО в объеме 0,5 мл на животное (малая – s1 и большая – s2 дозы СО), а третьей и четвертой группе – такой же объем рабочих растворов ИП (малая – u1 и большая – u2 дозы). Вторую постановку теста («перекрест») проводят не менее чем через неделю после первой.

Таблица – Схема двойного перекреста (последовательность введения рабочих растворов животным)

Испытание Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4
I постановка (день I) s1 s2 u1 u2
II постановка (день II) u2 u1 s2 s1

Взятие крови осуществляют трижды: непосредственно перед введением испытуемых растворов и через 1 и 2,5 ч после инъекции препарата. Примерно 50 мкл крови из краевой вены уха собирают в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл, содержащую 10 мкл раствора гепарина (5000 МЕ/мл).

Концентрацию глюкозы в крови животных определяют согласно разделу 4. Устанавливают среднюю величину, на которую снижается концентрация глюкозы в крови через 1 и 2,5 ч после введения рабочего раствора СО и ИП инсулина у каждого животного и выражают ее в процентах по отношению к исходной.

Из опыта исключают животных, которые отвечают судорогами на введение инсулина и тех, у которых снижение концентрации глюкозы в крови составляет менее 15 % по отношению к исходному уровню.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу 3.6 «Обработка результатов двойного перекреста (на примере биологической активности инсулина методом А и В)» ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Метод определения биологической активности инсулина по снижению концентрации глюкозы в крови мышей (метод B)

В опыт берут не менее 40 мышей-самок массой тела 20 – 28 г. Животных распределяют на 4 равные группы способом случайного отбора и метят (нумеруют) по порядку каждую особь внутри группы. Мышей содержат на стандартном рационе вивария с соблюдением санитарных правил. До и во время опыта животным должен быть обеспечен свободный доступ к корму и воде.

Непосредственно перед экспериментом из основных растворов СО и ИП готовят по 2 рабочих раствора (см. Общие положения, примечания 1, 2). Концентрация рабочих растворов должна находиться в диапазоне 0,06 – 1,2 МЕ/мл. Для аналогов инсулина возможно применение других концентраций. Большая доза рабочих растворов СО и ИП должна превышать малую не менее чем в 2 раза.

Согласно схеме двойного перекреста (табл.), мышам первой и второй группы подкожно в холку вводят рабочие растворы СО, а третьей и четвертой – такие же объемы рабочих растворов ИП по 0,1 мл/10 г массы тела животного. Рабочие растворы вводят каждому животному последовательно, в соответствии с нумерацией, через каждые 15 – 20 с. Так, например, на введение раствора группе из 12 животных необходимо 3 – 4 мин. Интервал между введениями рабочих растворов каждой группе животных должен составлять 1 – 2 мин.

После инъекции инсулина через (40 ± 1) мин последовательно в соответствии с номером каждого животного внутри группы из орбитального венозного синуса глаза осуществляют взятие около 50 мкл крови с помощью стерильного гепаринизированного капилляра. Необходимо соблюдать те же временные интервалы, что и при введении растворов. Пробы крови помещают в микроцентрифужные пробирки объемом 0,5 мл. Определение концентрации глюкозы в крови животных проводят согласно разделу 4.

Вторую постановку эксперимента (перекрест) проводят через 24 ч после первой.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу 3.6 «Обработка результатов двойного перекреста (на примере биологической активности инсулина методом А и В)», описанному в ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Если в фармакопейной статье даны иные указания, то следуют им.

Определение биоидентичности представляет собой вариант метода определения биологической активности инсулина и его аналогов, подтверждающий подлинность препарата с использованием минимального количества животных. Испытание проводят аналогично разделу 1 (метод А или B) со следующими изменениями:

  1. В опыт берут 8 кроликов по 2 в каждой группе (метод А) или 20 мышей по 5 в каждой группе (метод B).
  2. Не вычисляют доверительные границы величины биологической активности, так как используемое количество животных не позволяет провести статистическую обработку результатов. Метод является полуколичественным.

Препарат считают прошедшим испытание, если его биологическая активность составляет не менее 56 % от ожидаемой.

Если в фармакопейной статье даны иные указания, то следуют им.

Используют кроликов одного пола массой не менее 2,5 кг, которых содержат на стандартном рационе вивария. В опыт берут не менее 18 животных, которых способом случайного отбора распределяют на 2 равные группы. За 18–20 ч до исследования кроликов лишают корма, а перед опытом убирают воду.

Животным подкожно вводят одинаковую дозу основного раствора СО или неразведенного ИП (см. Общие положения примечание 1). Рекомендуемый диапазон доз составляет 0,5 – 0,8 МЕ/кг. Взятие крови проводят непосредственно перед инъекцией, а также через 1,5; 3,0; 4,5 и 6,0 ч после нее. Процедура взятия крови описана в разделе 1 (метод А). Определение концентрации глюкозы в крови животных проводят согласно разделу 4.

За контрольную временную точку принимают момент времени, при котором через 4,5 – 6 ч после инъекции средняя концентрация глюкозы в крови животных, получивших основной раствор СО, приблизится к 100 ± 15 % от исходного уровня. В этой точке для каждого кролика рассчитывают индивидуальную концентрацию глюкозы в крови в процентах относительно исходного уровня для данного животного.

Испытуемый препарат считают прошедшим испытание, если в контрольной временной точке у животных, получивших ИП, средняя относительная концентрация глюкозы в крови, рассчитанная из индивидуальных концентраций, достоверно ниже, чем у животных, получивших основной раствор СО. Достоверность различия проверяют с помощью критерия Стьюдента при доверительной вероятности Р = 0,95.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу 3.8 «Обработка результатов испытания на пролонгированное (удлиненное) действие лекарственных препаратов инсулина и его аналогов» ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Для определения концентрации глюкозы в плазме кроликов и мышей рекомендуется применять глюкозооксидазный метод с использованием многоканального фотоэлектроколориметра.

После каждого взятия крови пробы центрифугируют в течение 5 мин при температуре 5 о С и при величине относительного центробежного ускорения (ОЦУ), равной 1500 g (см. Примечание). От каждой пробы отбирают по 10 мкл плазмы и переносят в микрокювету плоскодонного 96-луночного планшета. Планшет с пробами можно хранить при температуре от 6 до 8 0 Сдо окончания испытания.

Перед измерением в каждую микрокювету с плазмой добавляют по 240 мкл реактива готового энзимо-хромогенного набора, например «GLUCOSE Liquicolor» или аналогичного. Планшеты инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение не менее 20 мин.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 492 нм.

В качестве раствора сравнения используют стандартный раствор глюкозы с концентрацией 5,55 ммоль/л (100 мг %), входящий в состав готового энзимо-хромогенного набора.

Концентрацию глюкозы (с) в крови рассчитывают по формуле:

где A – оптическая плотность пробы;

A0 – оптическая плотность глюкозы в растворе сравнения.

Примечание. Величина ОЦУ зависит от радиуса ротора центрифуги и скорости его вращения. Скорость вращения ν (об/мин) для обеспечения необходимой величины ОЦУ (в данном случае 1500 g) вычисляют по следующей формуле:

(21), (22) Заявка: 2008140687/13, 15.10.2008

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
15.10.2008

(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: WO 2005016974 A1, 24.02.2005. WO 2008012540 A1, 31.01.2008. WO 2006090119 A1, 31.08.2006. RU 2281756 C2, 10.05.2006.

Адрес для переписки:
117997, Москва, ГСП-7, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, ИБХ РАН, патентный отдел

(72) Автор(ы):
Безуглов Владимир Виленович (RU),
Грецкая Наталья Михайловна (RU),
Бобров Михаил Юрьевич (RU),
Акимов Михаил Геннадиевич (RU),
Баирамашвили Дмитрий Ильич (RU),
Шибанова Елена Дмитриевна (RU),
Клинов Дмитрий Владимирович (RU),
Мирошников Анатолий Иванович (RU)

(73) Патентообладатель(и):
Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральное агентство по науке и инновациям (RU)

(54) КОМПЛЕКС БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА С ПОЛИСИАЛОВОЙ КИСЛОТОЙ

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению белковых комплексов, и может быть использовано в медицине. Получают комплекс биологически активного рекомбинантного белка, нековалентно связанного с активированной в водном растворе при рН 4,4-4,7 полисиаловой кислотой, обладающий продолжительным терапевтическим действием, общей формулы:

где m=20-110; n=1-4; Р-биологически активный рекомбинантный белок. Изобретение позволяет получить комплекс биологически активного рекомбинантного белка с полисиаловой кислотой, обладающий стабильностью и пролонгированным действием. 2 табл., 6 ил.

Изобретение относится к области биохимии и может найти применение в медицине при получении биологически активных рекомбинантных белков, обладающих стабильностью и пролонгированным действием, имеющих терапевтическое значение, таких как инсулин человека, альфа- и бета-интерфероны, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор и др.

Для повышения устойчивости рекомбинантных белков в составе готовых лекарственных форм используют различные приемы: от ковалентной модификации белков низкомолекулярными и высокомолекулярными агентами до создания комплексов с биополимерами.

Известен способ приготовления препаратов инсулина пролонгированного действия в виде суспензии, образующейся в результате взаимодействия инсулина с протамин-сульфатом. При этом формируются кристаллы в растворе, содержащие в своем составе сам инсулин, протамина сульфат, ионы двухвалентного цинка и фенол. Препарат обладает пролонгированным действием за счет медленного растворения кристаллов в подкожной клетчатке и пролонгированным поступлением свободного инсулина в кровь. Это обеспечивает поддержание уровня глюкозы в крови на протяжении 12-16 часов после подкожного введения препарата протамина-инсулина (Патент РФ 2281756, МПК А61К 9/10, опубл. 2006).

Недостатками полученной пролонгированной формы препарата инсулина являются:

а) необходимость получения кристаллической суспензии, содержащей чужеродный для организма человека белок протамина сульфат;

б) сложность дозирования препарата при введении из-за неоднородности фазового состояния (суспензия кристаллов в растворе).

Известен способ стабилизации биологически активных белков с помощью комплексообразования с природными полисахаридами и аминокислотами (R.S.Brody, S.Alavattam, W.M.Fountain, R.L.Jones. Stabilization of biologically active proteins with mixtures of polysacchar/> 3), а боковые цепи из олигогалоктопиранозных звеньев присоединены связью (1 6). В состав молекул данного полисахарида входят также другие моносахаридные остатки, присоединенные к основной и боковой цепям. Гуммиарабик содержит также около 1% сильногликозилированных белков, таких как оксидазы и пероксидазы, активность которых необходимо дезактивировать перед соединением с белками, для предотвращения нежелательных побочных реакций с функциональными группами белка.

Недостатками получаемых по этому способу соединений являются: а) содержание примесей сильно гликозилированных белков вследствие использования смеси природных полисахаридов, которые практически невозможно отделить от полисахаридов; б) возможные нежелательные иммунные реакции пациентов на примесные белки и иммуногенные полисахариды; в) невозможность стандартизации готового белкового препарата из-за трудностей контроля состава сложных природных смесей. Известен наиболее близкий к заявленному комплекс генно-инженерных белков с сульфатированными полисахаридами (Y.Uemura, Н.Arimura, Н.Morise, S.Funakoshi, Т.Suyama. Process for recovering interferon. US 4314935). Комплекс получают путем взаимодействия раствора интерферона, произведенного клетками человека, с полисахаридом, содержащим отрицательно заряженные сульфогруппы. В качестве полисихарида используют бентонит или SP-сефадекс. Образующийся комплекс нерастворим в воде. При этом белок остается нативным и может быть отделен в виде данного комплекса от других примесей.

Однако данный способ не предназначен для приготовления растворимых в воде комплексов полимерных отрицательно заряженных углеводов с рекомбинантными белками.

Изобретение решает задачу расширения ассортимента стабильных, растворимых в воде биологически активных рекомбинантных белков с пролонгированным действием.

Поставленная задача решается за счет стабильного комплекса биологически активного рекомбинантного белка с полисиаловой кислотой, обладающего продолжительным терапевтическим действием, общей формулы:

где: m=20-110; n=1-4; Р — биологически активный рекомбинантный белок.

Полисиаловая кислота — природный биополимер, входящий в состав молекул адгезии нервных клеток млекопитающих и являющийся компонентом клеточной стенки некоторых бактерий (Gregoriadis G., McCormack В., Wang Z. et al. // FEBS Lett. 1993. V.315. P.271). Она не обладает иммуногенностью, узнается сиалидазами организма, расщепляющими ее до остатков нейраминовой кислоты, и выводится из организма. Полисиаловую кислоту используют для ковалентной модификации белков (S.Jain, Р.Laing, G.Gregoriadis, D.H.Hreczuk-Hrist, Y.P.apaoannou. Sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation. WO 2005016974), но нековалентные комплексы этой кислоты с белками, являющиеся предметом данного изобретения, не известны.

Комплекс полисиаловой кислоты с белками получают смешением растворов каждого из компонентов при определенном значении рН, обычно ниже 6.0, перемешиванием в течение некоторого времени с последующим доведением рН до определенных для данной лекарственной формы значений, обычно 7.4. Полисиаловую кислоту перед введением в состав комплекса активируют, подкислением ее водного раствора с последующим разделением на сефадексе G25. В отдельных случаях активацию полисиаловой кислоты проводят непосредственно перед приготовлением комплекса без стадии фильтрации через колонку с сефадексом. Полученные комплексы полисиаловой кислоты и белка могут храниться как в растворе, так и в виде лиофильно высушенного кристаллического препарата. Образование комплекса полисиаловая кислота-белок может быть зарегистрировано прямыми наблюдениями с помощью атомно-силового микроскопа. Пролонгированное действие рекомбинантных белков в составе комплекса с полисиаловой кислотой подтверждается данными биологических испытаний in vivo. Сохранение специфической биологической активности белка в комплексе с полисиаловой кислотой следует из данных экспериментов на культурах клеток, чувствительных к данным белкам. Повышение стабильности белковой молекулы к действию природных веществ, индуцирующих агрегацию, продемонстрировано специальным экспериментом.

Таким образом, заявляемое изобретение решает задачу повышения стабильности и длительности фармакологического действия генно-инженерных белков путем их введения в состав нековалентного комплекса с природной полисиаловой кислотой.

Изобретение иллюстрируют графические материалы.

Фиг.1. АСМ-изображение комплексов инсулина с полисиаловой кислотой. Масштаб 60 нм. А — молекулы инсулина.

Фиг.2. Электрофореграмма разделения в полиакриламидном геле. Полиакриламидный гель, неденатурирующие условия, без концентрирующего геля, рН 8.8, 8%Т, окрашивание EZBlue (Сигма, США). 1 — нативный интерферон , 2 — комплекс из примера 7, 3 — нативный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, 4 — комплекс из примера 6, 5-7 — маркеры молекулярной массы, 5 — карбангидраза, 6 — -лактоглобулин, 7 — БСА.

Фиг.3. Электрофореграмма инсулина и его комплекса с полисиаловой кислотой после инкубации с арахидоноилдофаминхиноном (AA-DAQ). Полиакриламидный гель, денатурирующие условия без восстановления, Трициновый буфер. 1 — комплекс инсулина с полисиаловой кислотой из примера 2, 2 — комплекс инсулина с полисиаловой кислотой из примера 2+AA-DAQ, 3 — инсулин + AA-DAQ, М — маркер.

Фиг.4. Влияние препаратов интерферона-альфа 26 на пролиферацию клеток линии Daudi. 1 — комплекс интерферона и полисиаловой кислоты 22 кДа, полученный, как указано в примере 5,2, стандартный образец интерферона альфа 2в.

Фиг.5. Влияние препаратов гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (ГКСФ) на пролиферацию клеток HL60, дифференцированных диметилсульфоксидом. 1 — препарат сравнения филграстим, 2 — комплекс ГКСФ и полисиаловой кислоты 22 кДа, полученный в примере 6.

Фиг.6. Влияние препаратов интерферона-бета 1б на пролиферацию клеток линии Daudi. 1 — комплекс интерферона и полисиаловой кислоты 22 кДа, полученный как указано в примере 7, 2, стандартный образец интерферона бета 1б.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1. Получение активированной полисиаловой кислоты.

К 110 мг полисиаловой кислоты 22 кДа (m=75) прибавляют 1.72 мл воды и перемешивают при комнатной температуре (23°С) 15 мин, измеряют рН. Значение 7.0. Прибавляют 70 мкл 0.5 М HCl, результирующий рН раствора 4.5. Колонку PD-10, заполненную сефадексом G25 (GE Healthcare, Англия), промывают водой, детектируя элюат при 240 нм. Наносят раствор полисиаловой кислоты и продолжают элюировать водой. Собирают фракции по поглощению при 240 нм. Основное вещество выходит в первой фракции, рН раствора 4.9. Эту фракцию (3.9 мл) переносят в круглодонную колбу и лиофилизуют. Получают 86 мг сухого кристаллического вещества. Хранят при температуре ниже -18°С.

Пример 2. Получение комплекса полисиаловой кислоты (m=50) с инсулином.

В сосуд с магнитной мешалкой помещают 250 мг полисиаловой кислоты с массой 15 кДа (m=50) и растворяют в 5 мл воды при перемешивании. Измеряют значение рН полученного раствора (обычно находится в пределах 6.5-5.5) и дотитровывают раствор до значения 4.5 0.5 М HCl. Одновременно приготавливают раствор субстанции генно-инженерного инсулина человека из 96 мг полипептида и 4 мл воды при рН 2.0. К полученному прозрачному раствору полисиаловой кислоты прибавляют при постоянном перемешивании порциями раствор инсулина в воде. Немедленно образуется объемный белый осадок. Перемешивают при комнатной температуре (23°С) 30 мин и доводят рН раствора до значения 6.75-7.0. Полученный раствор стерильно фильтруют через фильтр с диаметром пор 0.22 мкм и лиофилизуют. Получают 300 мг белого кристаллического вещества. Соотношение полисиаловая кислота — белок 1:1 (n=1).

Пример 3. Получение комплекса полисиаловой кислоты (m=20) с инсулином.

В сосуд с магнитной мешалкой помещают 250 мг полисиаловой кислоты с массой 6 кДа (m=20) и растворяют в 5 мл воды при перемешивании. Измеряют значение рН полученного раствора (обычно находится в пределах 6.5-5.5) и дотитровывают раствор до значения 4.5 0.5 М HCl. Одновременно приготавливают раствор субстанции генно-инженерного инсулина человека из 60 мг полипептида и 3 мл воды при рН 2.0. К полученному прозрачному раствору полисиаловой кислоты прибавляют при постоянном перемешивании порциями раствор инсулина в воде. Перемешивают при комнатной температуре (23°С) 30 мин и доводят рН раствора до значения 6.75-7.0. Полученный раствор стерильно фильтруют через фильтр с диаметром пор 0.22 мкм и лиофилизуют. Получают 280 мг белого кристаллического вещества. Соотношение полисиаловая кислота — белок 4:1 (n=4).

Пример 4. Получение комплекса полисиаловой кислоты (m=110) с инсулином.

В сосуд с магнитной мешалкой помещают 456 мг полисиаловой кислоты с массой 32 кДа (m=110) и растворяют в 9 мл воды при перемешивании. Измеряют значение рН полученного раствора (обычно находится в пределах 7.3-6.5) и дотитровывают раствор до значения 4.5±0.1 0.5 М HCl. Одновременно приготавливают раствор субстанции генно-инженерного инсулина человека из 73 мг полипептида и 3.2 мл воды при рН 2.0. К полученному прозрачному раствору полисиаловой кислоты прибавляют при постоянном перемешивании порциями раствор инсулина в воде. Немедленно образуется объемный белый осадок. Перемешивают при комнатной температуре (23°С) 30 мин и доводят рН раствора до значения 7.15±0.1. Полученный раствор стерильно фильтруют через Millex фильтр 0.22 мкм и лиофилизуют. Получают 495 мг белого кристаллического вещества. Соотношение полисиаловая кислота — белок 1:1 (n=1).

Пример 5. Получение комплекса полисиаловой кислоты с интерфероном альфа 2б.

457 мг активированной полисиаловой кислоты 22 кДа, полученной, как описано в примере 1, растворяют в 75 мл очищенной воды. Перемешивают при комнатной температуре (23-25°С) до полного растворения. Проверяют значение рН. В случае необходимости дотировывают 0.5 М раствором соляной кислоты до значения 4.6±0.1 под контролем рН-метра. К полученному раствору при перемешивании со скоростью 300±50 оборотов в минуту приливают 100 мл раствора белка с концентрацией интерферона 2±0.1 мг в мл, полученного на стадии перемешивают при комнатной температуре 30 мин. Доводят рН до значения 7.0 0.1 N NaOH и стерильно фильтруют. Соотношение полисиаловая кислота — белок 2:1.

Пример 6. Получение комплекса гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (ГКСФ) и полисиаловой кислоты.

Получают раствор комплекса ГКСФ и активированной полисиаловой кислоты 22 кДа, как описано в примере 4, из 745 мг полисиаловой кислоты и 28 мл раствора белка с концентрацией ГКСФ 9 мг в мл. Полученный раствор комплекса количественно вводят в хроматографическую колонку PD-50, заполненную сефадексом G50 (GE Healthcare, Англия). Колонку промывают не менее чем тремя объемами фосфатно-солевого буфера, рН 7.4. Контроль элюата осуществляют по нарастанию поглощения при 240 нм с помощью УФ-детектора. Фракции, соответствующие фронту, вершине и основной спадающей части пика собирают в полиэтиленовые пробирки на 15 мл. Фракции, предшествующие пику вещества, а также соответствующие его хвостовой части, отбрасывают. Измеряют объем раствора комплекса ГКСФ с полисиаловой кислотой после гель-хроматографии. Отбирают пробу 500 мкл для анализа содержания белка. По данным анализа рассчитывают количество фосфатно-солевого буфера (рН 7.4), которое требуется для получения концентрации 0.54-0.66 мг/мл и добавляют к раствору комплекса. Полученный раствор субстанции стерилизуют, пропуская через стерилизующий фильтр в асептических условиях. Соотношение полисиаловая кислота — белок 2:1.

Пример 7. Получение комплекса полисиаловой кислоты с интерфероном бета-1б.

В флакон из темного стекла на 4.5 мл помещают 2 мл готового раствора интерферона, содержащего 0.89 мг/мл белка в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7.3), содержащем 2% маннита. К данному раствору при перемешивании при комнатной температуре (20°С) прибавляют одной порцией раствор полисиаловой кислоты 22 кДа с концентрацией 27 мг/мл (рН 4.6). Перемешивают при этой температуре 35 мин. Дотитровывают до значения 7.2 0.1 М NaOH. Полученный раствор перемешивают 30 мин при комнатной температуре. Определяют концентрацию белка. При необходимости разбавляют 10 мМ фосфатным буфером (рН 7.3) до концентрации 0.25 мг/мл. Стерильно фильтруют. Соотношение полисиаловая кислота — белок 3:1.

Пример 8. Визуализация комплекса полисиаловой кислоты и инсулина человека с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ).

На поверхность свежесколотого высокоориентированного пиролитического графита (ВОПГ) наносят 40 мкл раствора-модификатора графита «GM» фирмы «Нанотюнинг» (Россия). После 10 мин инкубации каплю сдувают сжатым аргоном. На подготовленную таким образом поверхность ВОПГ наносят каплю водного раствора комплексов инсулин-полисиаловая кислота, полученного в примере 2 с концентрацией 0,1 мкг/мл. После инкубации в течение 5 мин каплю сдувают сжатым аргоном. АСМ-изображнения получены в прерывисто-контактном режиме с использованием сверхострых кантилеверов высокого разрешения производства «Нанотюнинг» (Россия) на приборе Solver Р-47 bio фирмы «НТ-МДТ» (Россия).

На фиг.1 представлены типичные АСМ-изображения комплексов инсулина с полисиаловой кислотой. Молекулы полисиаловой кислоты выглядят на АСМ-изображениях хорошо расправленными. Стрелками на фиг.1 указаны молекулы инсулина, имеющие большую высоту по сравнению с молекулами полисиаловой кислоты. Измеряемая в АСМ высота молекул полисиаловой кислоты — 0,3-0,5 нм, средняя длинна молекул — около 10-20 нм, что соответствует молекулярному весу 23 кД, с учетом сокращения длины молекулы за счет образования спиральных участков и изгибов. Взаимодействие носит специфичный характер, так как молекулы инсулина распределены неравномерно по всей длине молекулы полисиаловой кислоты и связаны преимущественно с одним из концов молекулы. Высота молекул инсулина, измеряемая при помощи АСМ, соответствует 0,7-1 нм.

Пример 9. Характеристика комплексов белков с полисиаловой кислотой с помощью электрофореза в полиактиламидном геле в неденатурирующих условиях.

Разделение проводят без концентрирующего геля, рН 8.8, 8%Т, окрашивание EZBlue (Сигма, США).

На фиг.2 показана типичная электрофореграмма комплексов белков с полисиаловой кислотой 22 кДа, полученных, как описано в примерах 6 и 7. Видно, что подвижность комплексов отличается от подвижности нативного белка.

Пример 10. Устойчивость комплексов рекомбинантных белков с полисиаловой кислотой к действию модифицирующих агентов.

Окисленная форма нейротрансмиттера дофамина (n-этиламино-о-бензохинон) предполагается в качестве повреждающего агента при болезни Паркинсона, причем известно, что она способна образовывать ковалентные аддукты с остатками цистеина и лизина различных белков. Для проверки устойчивости генно-инженерных белков в комплексе с полисиаловой кислотой к действию дофаминхинона используют его жирно-кислотное производное (арахидоноилдофаминхинон, AA-DAQ), обладающее большей стабильностью в водных растворах по сравнению с немодифицированным дофаминхиноном. Рекомбинантные белки (КСФ, интерфероны альфа 2б и бета 1б, а также инсулин) и их комплексы с полисиаловой кислотой инкубируют с пятикратным молярным избытком (относительно суммарной концентрации лизинов и аргининов) AA-DAQ при рН 7.4 или 6.5 в течение часа при 37°С и анализируют методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле в невосстанавливающих условиях. В отсутствие полисиаловой кислоты инкубация указанных белков в с AA-DAQ приводят к образованию олигомеров белков. Доминирующим продуктом является димер, за ним следуют тример и незначительное количество тетрамера. Комплексообразование с полисиаловой кислотой существенно снижает образование олигомеров. На фиг.3 представлена электрофореграмма типичного эксперимента с инсулином и его комплексом с полисиаловой кислотой. Электрофоретическое разделение проводили в денатурирующих условиях без восстановления с использованием Трицинового буфера согласно опубликованной методике (Judd R.C. Electrophoresis of Peptides // Methods in Molecular Biology. V. 32 Basic Protein and Peptide Protocols, Humana Press, 1994). Видно практически полное отсутствие олигомерных форм белка в образце, содержащем комплекс с полисиаловой кислотой.

Пример 11. Испытание биологической активности препарата инсулина на кроликах.

Биологическую активность и пролонгированное действие препарата определяют по снижению содержания глюкозы в крови у кроликов.

Используют кроликов одного пола массой 2.5÷3.5 кг, содержащихся на стандартном рационе вивария. В опыт берут не менее 18 животных, которых способом случайного отбора распределяют на две равные группы. Одной группе подкожно вводят неразведенный ИП (испытуемый препарат), другой группе — такую же дозу основного раствора СО (стандартного образца растворимого инсулина), соответствующей видовой специфичности. Рекомендуемый диапазон доз составляет 0.5÷0.8 МЕ/кг. Взятие крови из ушной вены кролика проводят непосредственно перед инъекцией и через 1.5; 3.0; 4.5 и 6.0 ч после нее. Определение содержания глюкозы в сыворотке крови проводят глюкозоксидазным методом с использованием набора «Глюкоза» (Human, Германия).

За контрольную временную точку принимают момент времени, когда средняя концентрация глюкозы в крови животных, получивших основной раствор СО, вернулась к исходному уровню (100%). В этой точке для каждого кролика, получившего СО или ИП, рассчитывают индивидуальную относительную концентрацию глюкозы в крови в процентах от исходного уровня у данного животного. Если за 6 ч средняя концентрация глюкозы в крови кроликов, получивших СО, не вернулась к исходному уровню, то в качестве контрольной временной точки принимают момент времени, в который средний уровень глюкозы в данной группе максимально приблизился к исходному.

ИП считают прошедшим испытание, если в контрольной временной точке средняя относительная концентрация глюкозы в крови животных, получивших ИП, рассчитанная из индивидуальных относительных концентраций, достоверно ниже, чем в крови животных, получивших основной раствор СО. Достоверность различия проверяют с помощью критерия Стьюдента при p Таблица 1 Испытание биологической активности комплекса инсулина с полисиаловой кислотой на кроликах Описание образца % снижения глюкозы через промежуток времени, ч 1.5 3 45 6 СО (Стандартный образец инсулина), 40 МЕ/мл 37 21 0 0 ИП (Комплекс инсулина с полисиаловой кислотой из примера 2), 40 МЕ/мл 43 30 18 21

Пример 12. Испытание биологической активности препарата инсулина на мышах.

Биологическую активность и пролонгированное действие препарата определяют по снижению содержания глюкозы в крови у мышей.

В опыт берут не менее 30 мышей с отклонением массы тела не более ±1.0 г. Мышей распределяют на 3 равные группы способом случайного отбора и метят по порядку каждую особь внутри группы.

Животным первой группы через каждые 15 секунд подкожно в холку вводят рабочий раствор стандартного образца (СО), приготовленный из основного раствора СО, в объеме 0,1 мл/10 г массы тела животного. Рабочий раствор СО готовят непосредственно перед экспериментом в концентрации 0,1 МЕ/мл.

Животным второй группы вводят рабочий раствор испытуемого препарата (ИП), в объеме 0,1 мл/10 г массы тела. Рабочий раствор ИП готовят аналогичным образом, непосредственно перед экспериментом, с концентрацией 0,1 МЕ/мл.

Временной интервал между введением каждого рабочего раствора должен составлять не менее двух минут.

Третьей (контрольной) группе вводят раствор, не содержащий инсулин (плацебо), в том же объеме и по той же схеме, что и опытным животным.

Взятие крови (около 50 мкл) проводят из орбитального венозного синуса с помощью стерильного гепаринизированного капилляра или пастеровской пипетки через 40±1 мин, 90±2 мин и 120±3 мин после инъекции инсулина в соответствии с номером каждого животного внутри группы, соблюдая те же временные интервалы, что и при введении растворов. Определение содержания глюкозы в сыворотке крови проводят глюкозоксидазным методом с использованием набора «Глюкоза» (Human, Германия). Рассчитывают среднее содержание глюкозы в крови у мышей каждой из трех групп в каждой временной точке. Определяют разность между средней концентрацией глюкозы в крови животных третьей, контрольной группы и средней концентрацией глюкозы в крови первой (получившей раствор СО) и второй (получившей раствор ИП) групп. Тест считается удовлетворительным, если полученные значения статистически значимы (р Таблица 2 Испытание биологической активности комплекса инсулина с полисиаловой кислотой на мышах Описание образца % снижения глюкозы через промежуток времени, мин 40 90 120 180 Контрольный раствор (плацебо) 0 0 0 0 СО (стандартный образец инсулина), 40 МЕ/мл 62 31 6 0 ИП (Комплекс инсулина с полисиаловой кислотой из примера 2), 40 МЕ/мл 68 38 32 27

Пример 13. Испытание биологической активности комплекса интерферона альфа 2б человека и полисиаловой кислоты на клеточных культурах.

Биологическая активность рекомбинантного интерферона альфа 2б человека в составе нековалентного нанокомплекса с полисиаловой кислотой определяют по способности этого препарата подавлять пролиферацию клеточной линии Дауди, полученной из лимфомы Беркита и являющейся стандартной моделью изучения антипролиферативного эффекта препаратов группы интерферонов.

Аликвоты растворов комплекса интерферона альфа 2б человека и полисиаловой кислоты 22 кДа, полученного, как указано в примере 5, и препарата сравнения в фосфатно-солевом буфере прибавляют к культуральной среде ARPMI 1640 с клетками Дауди с таким расчетом, чтобы конечная концентрация белка составила от 0.064 до 250 нг на мл среды. Клетки инкубируют с веществами в течение 72 часов. По истечении указанного срока определяют число жизнеспособных клеток в каждой пробе по сравнению с интактной клеточной линией. Каждый тест воспроизводят не менее пяти раз.

После инкубации определяли число жизнеспособных клеток с использованием колориметрического МТТ-анализа. Учет результатов по 3-4 измерениям для каждой концентрации каждого препарата производят по относительному количеству клеток линии Дауди в МТТ-тесте через 72 ч после внесения образцов.

Как видно из фиг.4, комплекс интерферона и полисиаловой кислоты оказывают стойкий антипролиферативный эффект, наблюдаемый при концентрации выше 1 нг/мл и полностью сопоставимый с таковым у стандартного препарата интерферона, что подтверждается и статистически по отсутствию достоверных различий между результатами испытаний.

Пример. 14. Испытание биологической активности комплекса гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (ГКСФ) человека и полисиаловой кислоты на клеточных культурах.

Испытание препарата комплекса рекомбинантного ГКСФ человека и полисиаловой кислоты 22 кДа проводят аналогично примеру 13, с тем отличием, что вместо клеток линии Daudi используют клетки линии миелоидной лейкемии человека — HL60, дифференцированные диметилсульфоксидом. Препаратом сравнения в данном случае выступало официальное лекарственное средство на основе рекомбинантного ГКСФ — Филграстим. Действие каждой навески препарата изучают при 3-кратном определении при том, что эксперимент воспроизводят трижды. Результаты пролиферативного действия испытуемых препаратов представлены на фиг.5.

На чертеже видно, что ГКСФ в составе нековалентного нанокомплекса с полисиаловой кислотой в полной мере обеспечивает пролиферативный эффект в отношении клеток миелоидного ростка кроветворения и при концентрации в культуральной среде выше 0.4 нг/мл не уступает в этом отношении официальному лекарственному средству.

Пример. 15. Испытание биологической активности комплекса интерферона бета 1б и полисиаловой кислоты на клеточных культурах.

Испытание препарата комплекса рекомбинантного интерферона бета 1б человека и полисиаловой кислоты 22 кДа проводят аналогично примеру 13. Препаратом сравнения являлся нативный интерферона бета 1б. Действие каждой навески препарата изучают при 3-кратном определении, при том, что эксперимент воспроизводят трижды. Результаты антипролиферативного действия испытуемых препаратов представлены на фиг.6.

Как видно из фиг.6, комплекс интерферона и полисиаловой кислоты оказывает стойкий антипролиферативный эффект, наблюдаемый при концентрации выше 10 нг/мл и полностью сопоставимый с таковым у стандартного препарата интерферона, что подтверждается и статистически по отсутствию достоверных различий между результатами испытаний.

Стабильный комплекс биологически активного рекомбинантного белка, нековалентно связанного с активированной в водном растворе при рН 4,4-4,7 полисиаловой кислотой, обладающий продолжительным терапевтическим действием, общей формулы:

где m=20-110; n=1-4; Р — биологически активный рекомбинантный белок.

Источник статьи: http://rustland.ru/pro-diabet/aktivnost-substantsii-insulina-opredelyayut-na-krolikah/

ОФС.1.2.4.0001.15 Биологические испытания инсулина

Содержимое (Table of Contents)

ОФС.1.2.4.0001.15 Биологические испытания инсулина

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Биологические испытания ОФС.1.2.4.0001.15

инсулина Взамен ОФС 42-0009-02

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на лекарственные средства, стандартные образцы и аналоги инсулина.

Биологические методы испытания инсулина основаны на сопоставлении гипогликемического (сахаропонижающего) действия испытуемого препарата (ИП) с гипогликемическим действием стандартного образца (СО) инсулина или соответствующих СО его аналогов. Биологические методы используют для определения следующих показателей качества:

— биологическая активность (раздел 1);

— пролонгированное действие (раздел 3).

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Биологические испытания инсулина и его аналогов отражают их терапевтическое действие. Показатель «Биологическая активность» позволяет количественно определять содержание гипогликемического действующего вещества. Данное определение может проводиться для аттестации СО инсулина при отработке новых производственных технологий для оценки качества и в ходе проверки стабильности в процессе установления срока годности (раздел 1).

Показатель «Биоидентичность» используется для подтверждения подлинности лекарственных средств инсулина или его аналогов по наличию у них гипогликемического действия (раздел 2).

«Пролонгированное действие» – показатель качества лекарственных препаратов инсулина удлиненного действия и их аналогов, который характеризует продолжительность гипогликемического эффекта во времени. Данный показатель является обязательным для всех пролонгированных препаратов и аналогов инсулина (раздел 3).

СО для биологических испытаний представляет собой активное вещество (инсулин человека, инсулин свиной, инсулин крупного рогатого скота, аналоги инсулина), обладающее гипогликемическим действием с указанием точной величины биологической активности, выраженной в международных единицах действия (МЕ) в пересчете на сухое вещество.

Допускается многократное использование животных для биологических испытаний лекарственных средств и аналогов инсулина: кроликов – не ранее чем через 2 недели, мышей не ранее чем через 1 неделю после проведения предыдущего испытания.

1.Приготовление основных растворов СО и ИП. Для проведения биологических испытаний готовят основной раствор СО инсулина или его аналога.

Точную навеску СО инсулина растворяют в соответствующем объеме растворителя для получения концентрации 100 МЕ/мл. В качестве растворителя применяют 0,9 % раствор натрия хлорида для инъекций, подкисленный 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты до рН 2,5–3,5. В фармакопейных статьях на аналоги инсулина могут быть указаны другие растворители.

Основной раствор следует хранить при температуре от 2 до 8 °С. Замораживание не допускается. Можно использовать только прозрачный раствор.

При определении биологической активности субстанции инсулина основной раствор ИП готовят таким же образом, что и основной раствор СО. Разведение субстанции проводят, исходя из величины биологической активности инсулина с учетом фактического содержания влаги.

  1. Приготовление рабочих растворов СО и ИП. Рабочие растворы СО и ИП готовят из основных растворов непосредственно перед испытанием, добавляя соответствующие объемы растворителя до получения требуемых концентраций. В качестве растворителя применяют 0,9 %раствор натрия хлорида для инъекций, подкисленный 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты до рН 2,5 – 3,5.

При определении биологической активности лекарственных препаратов инсулина пролонгированного действия, представляющих собой суспензии, ИП осторожно взбалтывают и отбирают 1,0 мл, к которому для полного растворения суспензии добавляют 0,2 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты. Таким образом, если исходная концентрация ИП равна100 МЕ/мл, то полученный раствор ИП будет иметь концентрацию 83,3 МЕ/мл. В дальнейшем полученный раствор используют для приготовления рабочих растворов ИП.

Основные и рабочие растворы аналогов инсулина готовят, как указано в фармакопейных статьях.

ИСПЫТАНИЯ

Раздел 1. Биологическая активность

Биологическую активность субстанций инсулина, его лекарственных форм и аналогов определяют одним из 2 методов по снижению концентрации глюкозы в крови:

  • – кроликов (метод А);
  • – мышей (метод В).

Метод определения биологической активности инсулина и его аналогов по снижению концентрации глюкозы в крови кроликов (метод А)

Испытания проводят на кроликах породы Шиншилла, массой тела от 2,5 кг. В опыте используют не менее 24 кроликов. Животных содержат на стандартном рационе с соблюдением санитарных правил. За 18 – 20 ч до эксперимента животных лишают корма, а перед началом испытания убирают воду.

Непосредственно перед экспериментом из основных растворов СО и ИП готовят по 2 рабочих раствора (см. Общие положения примечания 1 и 2). В зависимости от чувствительности животных рекомендуемые концентрации рабочих растворов СО для лекарственных средств инсулина – 1,0 и 2,0 МЕ/мл, а для аналогов инсулина – в диапазоне 1,0 – 4,0 МЕ/мл.

Животных распределяют на 4 равные группы способом случайного отбора. Каждая группа животных получает рабочие растворы СО и ИП в порядке, предусмотренном схемой двойного перекреста (табл.). Первой и второй группе животных подкожно вводят рабочие растворы СО в объеме 0,5 мл на животное (малая – s1 и большая – s2 дозы СО), а третьей и четвертой группе – такой же объем рабочих растворов ИП (малая – u1 и большая – u2 дозы). Вторую постановку теста («перекрест») проводят не менее чем через неделю после первой.

Таблица – Схема двойного перекреста (последовательность введения рабочих растворов животным)

Испытание Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4
I постановка (день I) s1 s2 u1 u2
II постановка (день II) u2 u1 s2 s1

Взятие крови осуществляют трижды: непосредственно перед введением испытуемых растворов и через 1 и 2,5 ч после инъекции препарата. Примерно 50 мкл крови из краевой вены уха собирают в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл, содержащую 10 мкл раствора гепарина (5000 МЕ/мл).

Концентрацию глюкозы в крови животных определяют согласно разделу 4. Устанавливают среднюю величину, на которую снижается концентрация глюкозы в крови через 1 и 2,5 ч после введения рабочего раствора СО и ИП инсулина у каждого животного и выражают ее в процентах по отношению к исходной.

Из опыта исключают животных, которые отвечают судорогами на введение инсулина и тех, у которых снижение концентрации глюкозы в крови составляет менее 15 % по отношению к исходному уровню.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу 3.6 «Обработка результатов двойного перекреста (на примере биологической активности инсулина методом А и В)» ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Метод определения биологической активности инсулина по снижению концентрации глюкозы в крови мышей (метод B)

В опыт берут не менее 40 мышей-самок массой тела 20 – 28 г. Животных распределяют на 4 равные группы способом случайного отбора и метят (нумеруют) по порядку каждую особь внутри группы. Мышей содержат на стандартном рационе вивария с соблюдением санитарных правил. До и во время опыта животным должен быть обеспечен свободный доступ к корму и воде.

Непосредственно перед экспериментом из основных растворов СО и ИП готовят по 2 рабочих раствора (см. Общие положения, примечания 1, 2). Концентрация рабочих растворов должна находиться в диапазоне 0,06 – 1,2 МЕ/мл. Для аналогов инсулина возможно применение других концентраций. Большая доза рабочих растворов СО и ИП должна превышать малую не менее чем в 2 раза.

Согласно схеме двойного перекреста (табл.), мышам первой и второй группы подкожно в холку вводят рабочие растворы СО, а третьей и четвертой – такие же объемы рабочих растворов ИП по 0,1 мл/10 г массы тела животного. Рабочие растворы вводят каждому животному последовательно, в соответствии с нумерацией, через каждые 15 – 20 с. Так, например, на введение раствора группе из 12 животных необходимо 3 – 4 мин. Интервал между введениями рабочих растворов каждой группе животных должен составлять 1 – 2 мин.

После инъекции инсулина через (40 ± 1) мин последовательно в соответствии с номером каждого животного внутри группы из орбитального венозного синуса глаза осуществляют взятие около 50 мкл крови с помощью стерильного гепаринизированного капилляра. Необходимо соблюдать те же временные интервалы, что и при введении растворов. Пробы крови помещают в микроцентрифужные пробирки объемом 0,5 мл. Определение концентрации глюкозы в крови животных проводят согласно разделу 4.

Вторую постановку эксперимента (перекрест) проводят через 24 ч после первой.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу 3.6 «Обработка результатов двойного перекреста (на примере биологической активности инсулина методом А и В)», описанному в ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Если в фармакопейной статье даны иные указания, то следуют им.

Раздел 2. Биоидентичность

Определение биоидентичности представляет собой вариант метода определения биологической активности инсулина и его аналогов, подтверждающий подлинность препарата с использованием минимального количества животных. Испытание проводят аналогично разделу 1 (метод А или B) со следующими изменениями:

  1. В опыт берут 8 кроликов по 2 в каждой группе (метод А) или 20 мышей по 5 в каждой группе (метод B).
  2. Не вычисляют доверительные границы величины биологической активности, так как используемое количество животных не позволяет провести статистическую обработку результатов. Метод является полуколичественным.

Препарат считают прошедшим испытание, если его биологическая активность составляет не менее 56 % от ожидаемой.

Если в фармакопейной статье даны иные указания, то следуют им.

Раздел 3. Пролонгированное действие лекарственных препаратов инсулина

Используют кроликов одного пола массой не менее 2,5 кг, которых содержат на стандартном рационе вивария. В опыт берут не менее 18 животных, которых способом случайного отбора распределяют на 2 равные группы. За 18–20 ч до исследования кроликов лишают корма, а перед опытом убирают воду.

Животным подкожно вводят одинаковую дозу основного раствора СО или неразведенного ИП (см. Общие положения примечание 1). Рекомендуемый диапазон доз составляет 0,5 – 0,8 МЕ/кг. Взятие крови проводят непосредственно перед инъекцией, а также через 1,5; 3,0; 4,5 и 6,0 ч после нее. Процедура взятия крови описана в разделе 1 (метод А). Определение концентрации глюкозы в крови животных проводят согласно разделу 4.

За контрольную временную точку принимают момент времени, при котором через 4,5 – 6 ч после инъекции средняя концентрация глюкозы в крови животных, получивших основной раствор СО, приблизится к 100 ± 15 % от исходного уровня. В этой точке для каждого кролика рассчитывают индивидуальную концентрацию глюкозы в крови в процентах относительно исходного уровня для данного животного.

Испытуемый препарат считают прошедшим испытание, если в контрольной временной точке у животных, получивших ИП, средняя относительная концентрация глюкозы в крови, рассчитанная из индивидуальных концентраций, достоверно ниже, чем у животных, получивших основной раствор СО. Достоверность различия проверяют с помощью критерия Стьюдента при доверительной вероятности Р = 0,95.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу 3.8 «Обработка результатов испытания на пролонгированное (удлиненное) действие лекарственных препаратов инсулина и его аналогов» ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Раздел 4. Определение концентрации глюкозы в плазме животных

Для определения концентрации глюкозы в плазме кроликов и мышей рекомендуется применять глюкозооксидазный метод с использованием многоканального фотоэлектроколориметра.

После каждого взятия крови пробы центрифугируют в течение 5 мин при температуре 5 о С и при величине относительного центробежного ускорения (ОЦУ), равной 1500 g (см. Примечание). От каждой пробы отбирают по 10 мкл плазмы и переносят в микрокювету плоскодонного 96-луночного планшета. Планшет с пробами можно хранить при температуре от 6 до 8 0 Сдо окончания испытания.

Перед измерением в каждую микрокювету с плазмой добавляют по 240 мкл реактива готового энзимо-хромогенного набора, например «GLUCOSE Liquicolor» или аналогичного. Планшеты инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение не менее 20 мин.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 492 нм.

В качестве раствора сравнения используют стандартный раствор глюкозы с концентрацией 5,55 ммоль/л (100 мг %), входящий в состав готового энзимо-хромогенного набора.

Концентрацию глюкозы (с) в крови рассчитывают по формуле:

где A – оптическая плотность пробы;

A0 – оптическая плотность глюкозы в растворе сравнения.

Примечание. Величина ОЦУ зависит от радиуса ротора центрифуги и скорости его вращения. Скорость вращения ν (об/мин) для обеспечения необходимой величины ОЦУ (в данном случае 1500 g) вычисляют по следующей формуле:

Источник статьи: http://pharmacopoeia.ru/ofs-1-2-4-0001-15-biologicheskie-ispytaniya-insulina/

bezinsulina