Активность субстанции инсулина определяют на мышах

ОФС.1.2.4.0001.15 Биологические испытания инсулина

Содержимое (Table of Contents)

ОФС.1.2.4.0001.15 Биологические испытания инсулина

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Биологические испытания ОФС.1.2.4.0001.15

инсулина Взамен ОФС 42-0009-02

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на лекарственные средства, стандартные образцы и аналоги инсулина.

Биологические методы испытания инсулина основаны на сопоставлении гипогликемического (сахаропонижающего) действия испытуемого препарата (ИП) с гипогликемическим действием стандартного образца (СО) инсулина или соответствующих СО его аналогов. Биологические методы используют для определения следующих показателей качества:

— биологическая активность (раздел 1);

— пролонгированное действие (раздел 3).

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Биологические испытания инсулина и его аналогов отражают их терапевтическое действие. Показатель «Биологическая активность» позволяет количественно определять содержание гипогликемического действующего вещества. Данное определение может проводиться для аттестации СО инсулина при отработке новых производственных технологий для оценки качества и в ходе проверки стабильности в процессе установления срока годности (раздел 1).

Показатель «Биоидентичность» используется для подтверждения подлинности лекарственных средств инсулина или его аналогов по наличию у них гипогликемического действия (раздел 2).

«Пролонгированное действие» – показатель качества лекарственных препаратов инсулина удлиненного действия и их аналогов, который характеризует продолжительность гипогликемического эффекта во времени. Данный показатель является обязательным для всех пролонгированных препаратов и аналогов инсулина (раздел 3).

СО для биологических испытаний представляет собой активное вещество (инсулин человека, инсулин свиной, инсулин крупного рогатого скота, аналоги инсулина), обладающее гипогликемическим действием с указанием точной величины биологической активности, выраженной в международных единицах действия (МЕ) в пересчете на сухое вещество.

Допускается многократное использование животных для биологических испытаний лекарственных средств и аналогов инсулина: кроликов – не ранее чем через 2 недели, мышей не ранее чем через 1 неделю после проведения предыдущего испытания.

1.Приготовление основных растворов СО и ИП. Для проведения биологических испытаний готовят основной раствор СО инсулина или его аналога.

Точную навеску СО инсулина растворяют в соответствующем объеме растворителя для получения концентрации 100 МЕ/мл. В качестве растворителя применяют 0,9 % раствор натрия хлорида для инъекций, подкисленный 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты до рН 2,5–3,5. В фармакопейных статьях на аналоги инсулина могут быть указаны другие растворители.

Основной раствор следует хранить при температуре от 2 до 8 °С. Замораживание не допускается. Можно использовать только прозрачный раствор.

При определении биологической активности субстанции инсулина основной раствор ИП готовят таким же образом, что и основной раствор СО. Разведение субстанции проводят, исходя из величины биологической активности инсулина с учетом фактического содержания влаги.

  1. Приготовление рабочих растворов СО и ИП. Рабочие растворы СО и ИП готовят из основных растворов непосредственно перед испытанием, добавляя соответствующие объемы растворителя до получения требуемых концентраций. В качестве растворителя применяют 0,9 %раствор натрия хлорида для инъекций, подкисленный 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты до рН 2,5 – 3,5.

При определении биологической активности лекарственных препаратов инсулина пролонгированного действия, представляющих собой суспензии, ИП осторожно взбалтывают и отбирают 1,0 мл, к которому для полного растворения суспензии добавляют 0,2 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты. Таким образом, если исходная концентрация ИП равна100 МЕ/мл, то полученный раствор ИП будет иметь концентрацию 83,3 МЕ/мл. В дальнейшем полученный раствор используют для приготовления рабочих растворов ИП.

Основные и рабочие растворы аналогов инсулина готовят, как указано в фармакопейных статьях.

ИСПЫТАНИЯ

Раздел 1. Биологическая активность

Биологическую активность субстанций инсулина, его лекарственных форм и аналогов определяют одним из 2 методов по снижению концентрации глюкозы в крови:

  • – кроликов (метод А);
  • – мышей (метод В).

Метод определения биологической активности инсулина и его аналогов по снижению концентрации глюкозы в крови кроликов (метод А)

Испытания проводят на кроликах породы Шиншилла, массой тела от 2,5 кг. В опыте используют не менее 24 кроликов. Животных содержат на стандартном рационе с соблюдением санитарных правил. За 18 – 20 ч до эксперимента животных лишают корма, а перед началом испытания убирают воду.

Непосредственно перед экспериментом из основных растворов СО и ИП готовят по 2 рабочих раствора (см. Общие положения примечания 1 и 2). В зависимости от чувствительности животных рекомендуемые концентрации рабочих растворов СО для лекарственных средств инсулина – 1,0 и 2,0 МЕ/мл, а для аналогов инсулина – в диапазоне 1,0 – 4,0 МЕ/мл.

Животных распределяют на 4 равные группы способом случайного отбора. Каждая группа животных получает рабочие растворы СО и ИП в порядке, предусмотренном схемой двойного перекреста (табл.). Первой и второй группе животных подкожно вводят рабочие растворы СО в объеме 0,5 мл на животное (малая – s1 и большая – s2 дозы СО), а третьей и четвертой группе – такой же объем рабочих растворов ИП (малая – u1 и большая – u2 дозы). Вторую постановку теста («перекрест») проводят не менее чем через неделю после первой.

Таблица – Схема двойного перекреста (последовательность введения рабочих растворов животным)

Испытание Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4
I постановка (день I) s1 s2 u1 u2
II постановка (день II) u2 u1 s2 s1

Взятие крови осуществляют трижды: непосредственно перед введением испытуемых растворов и через 1 и 2,5 ч после инъекции препарата. Примерно 50 мкл крови из краевой вены уха собирают в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл, содержащую 10 мкл раствора гепарина (5000 МЕ/мл).

Концентрацию глюкозы в крови животных определяют согласно разделу 4. Устанавливают среднюю величину, на которую снижается концентрация глюкозы в крови через 1 и 2,5 ч после введения рабочего раствора СО и ИП инсулина у каждого животного и выражают ее в процентах по отношению к исходной.

Из опыта исключают животных, которые отвечают судорогами на введение инсулина и тех, у которых снижение концентрации глюкозы в крови составляет менее 15 % по отношению к исходному уровню.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу 3.6 «Обработка результатов двойного перекреста (на примере биологической активности инсулина методом А и В)» ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Метод определения биологической активности инсулина по снижению концентрации глюкозы в крови мышей (метод B)

В опыт берут не менее 40 мышей-самок массой тела 20 – 28 г. Животных распределяют на 4 равные группы способом случайного отбора и метят (нумеруют) по порядку каждую особь внутри группы. Мышей содержат на стандартном рационе вивария с соблюдением санитарных правил. До и во время опыта животным должен быть обеспечен свободный доступ к корму и воде.

Непосредственно перед экспериментом из основных растворов СО и ИП готовят по 2 рабочих раствора (см. Общие положения, примечания 1, 2). Концентрация рабочих растворов должна находиться в диапазоне 0,06 – 1,2 МЕ/мл. Для аналогов инсулина возможно применение других концентраций. Большая доза рабочих растворов СО и ИП должна превышать малую не менее чем в 2 раза.

Согласно схеме двойного перекреста (табл.), мышам первой и второй группы подкожно в холку вводят рабочие растворы СО, а третьей и четвертой – такие же объемы рабочих растворов ИП по 0,1 мл/10 г массы тела животного. Рабочие растворы вводят каждому животному последовательно, в соответствии с нумерацией, через каждые 15 – 20 с. Так, например, на введение раствора группе из 12 животных необходимо 3 – 4 мин. Интервал между введениями рабочих растворов каждой группе животных должен составлять 1 – 2 мин.

После инъекции инсулина через (40 ± 1) мин последовательно в соответствии с номером каждого животного внутри группы из орбитального венозного синуса глаза осуществляют взятие около 50 мкл крови с помощью стерильного гепаринизированного капилляра. Необходимо соблюдать те же временные интервалы, что и при введении растворов. Пробы крови помещают в микроцентрифужные пробирки объемом 0,5 мл. Определение концентрации глюкозы в крови животных проводят согласно разделу 4.

Вторую постановку эксперимента (перекрест) проводят через 24 ч после первой.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу 3.6 «Обработка результатов двойного перекреста (на примере биологической активности инсулина методом А и В)», описанному в ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Если в фармакопейной статье даны иные указания, то следуют им.

Раздел 2. Биоидентичность

Определение биоидентичности представляет собой вариант метода определения биологической активности инсулина и его аналогов, подтверждающий подлинность препарата с использованием минимального количества животных. Испытание проводят аналогично разделу 1 (метод А или B) со следующими изменениями:

  1. В опыт берут 8 кроликов по 2 в каждой группе (метод А) или 20 мышей по 5 в каждой группе (метод B).
  2. Не вычисляют доверительные границы величины биологической активности, так как используемое количество животных не позволяет провести статистическую обработку результатов. Метод является полуколичественным.

Препарат считают прошедшим испытание, если его биологическая активность составляет не менее 56 % от ожидаемой.

Если в фармакопейной статье даны иные указания, то следуют им.

Раздел 3. Пролонгированное действие лекарственных препаратов инсулина

Используют кроликов одного пола массой не менее 2,5 кг, которых содержат на стандартном рационе вивария. В опыт берут не менее 18 животных, которых способом случайного отбора распределяют на 2 равные группы. За 18–20 ч до исследования кроликов лишают корма, а перед опытом убирают воду.

Животным подкожно вводят одинаковую дозу основного раствора СО или неразведенного ИП (см. Общие положения примечание 1). Рекомендуемый диапазон доз составляет 0,5 – 0,8 МЕ/кг. Взятие крови проводят непосредственно перед инъекцией, а также через 1,5; 3,0; 4,5 и 6,0 ч после нее. Процедура взятия крови описана в разделе 1 (метод А). Определение концентрации глюкозы в крови животных проводят согласно разделу 4.

За контрольную временную точку принимают момент времени, при котором через 4,5 – 6 ч после инъекции средняя концентрация глюкозы в крови животных, получивших основной раствор СО, приблизится к 100 ± 15 % от исходного уровня. В этой точке для каждого кролика рассчитывают индивидуальную концентрацию глюкозы в крови в процентах относительно исходного уровня для данного животного.

Испытуемый препарат считают прошедшим испытание, если в контрольной временной точке у животных, получивших ИП, средняя относительная концентрация глюкозы в крови, рассчитанная из индивидуальных концентраций, достоверно ниже, чем у животных, получивших основной раствор СО. Достоверность различия проверяют с помощью критерия Стьюдента при доверительной вероятности Р = 0,95.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу 3.8 «Обработка результатов испытания на пролонгированное (удлиненное) действие лекарственных препаратов инсулина и его аналогов» ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Раздел 4. Определение концентрации глюкозы в плазме животных

Для определения концентрации глюкозы в плазме кроликов и мышей рекомендуется применять глюкозооксидазный метод с использованием многоканального фотоэлектроколориметра.

После каждого взятия крови пробы центрифугируют в течение 5 мин при температуре 5 о С и при величине относительного центробежного ускорения (ОЦУ), равной 1500 g (см. Примечание). От каждой пробы отбирают по 10 мкл плазмы и переносят в микрокювету плоскодонного 96-луночного планшета. Планшет с пробами можно хранить при температуре от 6 до 8 0 Сдо окончания испытания.

Перед измерением в каждую микрокювету с плазмой добавляют по 240 мкл реактива готового энзимо-хромогенного набора, например «GLUCOSE Liquicolor» или аналогичного. Планшеты инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение не менее 20 мин.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 492 нм.

В качестве раствора сравнения используют стандартный раствор глюкозы с концентрацией 5,55 ммоль/л (100 мг %), входящий в состав готового энзимо-хромогенного набора.

Концентрацию глюкозы (с) в крови рассчитывают по формуле:

где A – оптическая плотность пробы;

A0 – оптическая плотность глюкозы в растворе сравнения.

Примечание. Величина ОЦУ зависит от радиуса ротора центрифуги и скорости его вращения. Скорость вращения ν (об/мин) для обеспечения необходимой величины ОЦУ (в данном случае 1500 g) вычисляют по следующей формуле:

Источник статьи: http://pharmacopoeia.ru/ofs-1-2-4-0001-15-biologicheskie-ispytaniya-insulina/

Активность субстанции инсулина определяют на кроликах

Содержимое (Table of Contents)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Биологические испытания ОФС.1.2.4.0001.15

инсулина Взамен ОФС 42-0009-02

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на лекарственные средства, стандартные образцы и аналоги инсулина.

Биологические методы испытания инсулина основаны на сопоставлении гипогликемического (сахаропонижающего) действия испытуемого препарата (ИП) с гипогликемическим действием стандартного образца (СО) инсулина или соответствующих СО его аналогов. Биологические методы используют для определения следующих показателей качества:

— биологическая активность (раздел 1);

— пролонгированное действие (раздел 3).

Биологические испытания инсулина и его аналогов отражают их терапевтическое действие. Показатель «Биологическая активность» позволяет количественно определять содержание гипогликемического действующего вещества. Данное определение может проводиться для аттестации СО инсулина при отработке новых производственных технологий для оценки качества и в ходе проверки стабильности в процессе установления срока годности (раздел 1).

Показатель «Биоидентичность» используется для подтверждения подлинности лекарственных средств инсулина или его аналогов по наличию у них гипогликемического действия (раздел 2).

«Пролонгированное действие» – показатель качества лекарственных препаратов инсулина удлиненного действия и их аналогов, который характеризует продолжительность гипогликемического эффекта во времени. Данный показатель является обязательным для всех пролонгированных препаратов и аналогов инсулина (раздел 3).

СО для биологических испытаний представляет собой активное вещество (инсулин человека, инсулин свиной, инсулин крупного рогатого скота, аналоги инсулина), обладающее гипогликемическим действием с указанием точной величины биологической активности, выраженной в международных единицах действия (МЕ) в пересчете на сухое вещество.

Допускается многократное использование животных для биологических испытаний лекарственных средств и аналогов инсулина: кроликов – не ранее чем через 2 недели, мышей не ранее чем через 1 неделю после проведения предыдущего испытания.

1.Приготовление основных растворов СО и ИП. Для проведения биологических испытаний готовят основной раствор СО инсулина или его аналога.

Точную навеску СО инсулина растворяют в соответствующем объеме растворителя для получения концентрации 100 МЕ/мл. В качестве растворителя применяют 0,9 % раствор натрия хлорида для инъекций, подкисленный 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты до рН 2,5–3,5. В фармакопейных статьях на аналоги инсулина могут быть указаны другие растворители.

Основной раствор следует хранить при температуре от 2 до 8 °С. Замораживание не допускается. Можно использовать только прозрачный раствор.

При определении биологической активности субстанции инсулина основной раствор ИП готовят таким же образом, что и основной раствор СО. Разведение субстанции проводят, исходя из величины биологической активности инсулина с учетом фактического содержания влаги.

  1. Приготовление рабочих растворов СО и ИП. Рабочие растворы СО и ИП готовят из основных растворов непосредственно перед испытанием, добавляя соответствующие объемы растворителя до получения требуемых концентраций. В качестве растворителя применяют 0,9 %раствор натрия хлорида для инъекций, подкисленный 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты до рН 2,5 – 3,5.

При определении биологической активности лекарственных препаратов инсулина пролонгированного действия, представляющих собой суспензии, ИП осторожно взбалтывают и отбирают 1,0 мл, к которому для полного растворения суспензии добавляют 0,2 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты. Таким образом, если исходная концентрация ИП равна100 МЕ/мл, то полученный раствор ИП будет иметь концентрацию 83,3 МЕ/мл. В дальнейшем полученный раствор используют для приготовления рабочих растворов ИП.

Основные и рабочие растворы аналогов инсулина готовят, как указано в фармакопейных статьях.

Биологическую активность субстанций инсулина, его лекарственных форм и аналогов определяют одним из 2 методов по снижению концентрации глюкозы в крови:

Метод определения биологической активности инсулина и его аналогов по снижению концентрации глюкозы в крови кроликов (метод А)

Испытания проводят на кроликах породы Шиншилла, массой тела от 2,5 кг. В опыте используют не менее 24 кроликов. Животных содержат на стандартном рационе с соблюдением санитарных правил. За 18 – 20 ч до эксперимента животных лишают корма, а перед началом испытания убирают воду.

Непосредственно перед экспериментом из основных растворов СО и ИП готовят по 2 рабочих раствора (см. Общие положения примечания 1 и 2). В зависимости от чувствительности животных рекомендуемые концентрации рабочих растворов СО для лекарственных средств инсулина – 1,0 и 2,0 МЕ/мл, а для аналогов инсулина – в диапазоне 1,0 – 4,0 МЕ/мл.

Животных распределяют на 4 равные группы способом случайного отбора. Каждая группа животных получает рабочие растворы СО и ИП в порядке, предусмотренном схемой двойного перекреста (табл.). Первой и второй группе животных подкожно вводят рабочие растворы СО в объеме 0,5 мл на животное (малая – s1 и большая – s2 дозы СО), а третьей и четвертой группе – такой же объем рабочих растворов ИП (малая – u1 и большая – u2 дозы). Вторую постановку теста («перекрест») проводят не менее чем через неделю после первой.

Таблица – Схема двойного перекреста (последовательность введения рабочих растворов животным)

Испытание Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4
I постановка (день I) s1 s2 u1 u2
II постановка (день II) u2 u1 s2 s1

Взятие крови осуществляют трижды: непосредственно перед введением испытуемых растворов и через 1 и 2,5 ч после инъекции препарата. Примерно 50 мкл крови из краевой вены уха собирают в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл, содержащую 10 мкл раствора гепарина (5000 МЕ/мл).

Концентрацию глюкозы в крови животных определяют согласно разделу 4. Устанавливают среднюю величину, на которую снижается концентрация глюкозы в крови через 1 и 2,5 ч после введения рабочего раствора СО и ИП инсулина у каждого животного и выражают ее в процентах по отношению к исходной.

Из опыта исключают животных, которые отвечают судорогами на введение инсулина и тех, у которых снижение концентрации глюкозы в крови составляет менее 15 % по отношению к исходному уровню.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу 3.6 «Обработка результатов двойного перекреста (на примере биологической активности инсулина методом А и В)» ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Метод определения биологической активности инсулина по снижению концентрации глюкозы в крови мышей (метод B)

В опыт берут не менее 40 мышей-самок массой тела 20 – 28 г. Животных распределяют на 4 равные группы способом случайного отбора и метят (нумеруют) по порядку каждую особь внутри группы. Мышей содержат на стандартном рационе вивария с соблюдением санитарных правил. До и во время опыта животным должен быть обеспечен свободный доступ к корму и воде.

Непосредственно перед экспериментом из основных растворов СО и ИП готовят по 2 рабочих раствора (см. Общие положения, примечания 1, 2). Концентрация рабочих растворов должна находиться в диапазоне 0,06 – 1,2 МЕ/мл. Для аналогов инсулина возможно применение других концентраций. Большая доза рабочих растворов СО и ИП должна превышать малую не менее чем в 2 раза.

Согласно схеме двойного перекреста (табл.), мышам первой и второй группы подкожно в холку вводят рабочие растворы СО, а третьей и четвертой – такие же объемы рабочих растворов ИП по 0,1 мл/10 г массы тела животного. Рабочие растворы вводят каждому животному последовательно, в соответствии с нумерацией, через каждые 15 – 20 с. Так, например, на введение раствора группе из 12 животных необходимо 3 – 4 мин. Интервал между введениями рабочих растворов каждой группе животных должен составлять 1 – 2 мин.

После инъекции инсулина через (40 ± 1) мин последовательно в соответствии с номером каждого животного внутри группы из орбитального венозного синуса глаза осуществляют взятие около 50 мкл крови с помощью стерильного гепаринизированного капилляра. Необходимо соблюдать те же временные интервалы, что и при введении растворов. Пробы крови помещают в микроцентрифужные пробирки объемом 0,5 мл. Определение концентрации глюкозы в крови животных проводят согласно разделу 4.

Вторую постановку эксперимента (перекрест) проводят через 24 ч после первой.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу 3.6 «Обработка результатов двойного перекреста (на примере биологической активности инсулина методом А и В)», описанному в ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Если в фармакопейной статье даны иные указания, то следуют им.

Определение биоидентичности представляет собой вариант метода определения биологической активности инсулина и его аналогов, подтверждающий подлинность препарата с использованием минимального количества животных. Испытание проводят аналогично разделу 1 (метод А или B) со следующими изменениями:

  1. В опыт берут 8 кроликов по 2 в каждой группе (метод А) или 20 мышей по 5 в каждой группе (метод B).
  2. Не вычисляют доверительные границы величины биологической активности, так как используемое количество животных не позволяет провести статистическую обработку результатов. Метод является полуколичественным.

Препарат считают прошедшим испытание, если его биологическая активность составляет не менее 56 % от ожидаемой.

Если в фармакопейной статье даны иные указания, то следуют им.

Используют кроликов одного пола массой не менее 2,5 кг, которых содержат на стандартном рационе вивария. В опыт берут не менее 18 животных, которых способом случайного отбора распределяют на 2 равные группы. За 18–20 ч до исследования кроликов лишают корма, а перед опытом убирают воду.

Животным подкожно вводят одинаковую дозу основного раствора СО или неразведенного ИП (см. Общие положения примечание 1). Рекомендуемый диапазон доз составляет 0,5 – 0,8 МЕ/кг. Взятие крови проводят непосредственно перед инъекцией, а также через 1,5; 3,0; 4,5 и 6,0 ч после нее. Процедура взятия крови описана в разделе 1 (метод А). Определение концентрации глюкозы в крови животных проводят согласно разделу 4.

За контрольную временную точку принимают момент времени, при котором через 4,5 – 6 ч после инъекции средняя концентрация глюкозы в крови животных, получивших основной раствор СО, приблизится к 100 ± 15 % от исходного уровня. В этой точке для каждого кролика рассчитывают индивидуальную концентрацию глюкозы в крови в процентах относительно исходного уровня для данного животного.

Испытуемый препарат считают прошедшим испытание, если в контрольной временной точке у животных, получивших ИП, средняя относительная концентрация глюкозы в крови, рассчитанная из индивидуальных концентраций, достоверно ниже, чем у животных, получивших основной раствор СО. Достоверность различия проверяют с помощью критерия Стьюдента при доверительной вероятности Р = 0,95.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу 3.8 «Обработка результатов испытания на пролонгированное (удлиненное) действие лекарственных препаратов инсулина и его аналогов» ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Для определения концентрации глюкозы в плазме кроликов и мышей рекомендуется применять глюкозооксидазный метод с использованием многоканального фотоэлектроколориметра.

После каждого взятия крови пробы центрифугируют в течение 5 мин при температуре 5 о С и при величине относительного центробежного ускорения (ОЦУ), равной 1500 g (см. Примечание). От каждой пробы отбирают по 10 мкл плазмы и переносят в микрокювету плоскодонного 96-луночного планшета. Планшет с пробами можно хранить при температуре от 6 до 8 0 Сдо окончания испытания.

Перед измерением в каждую микрокювету с плазмой добавляют по 240 мкл реактива готового энзимо-хромогенного набора, например «GLUCOSE Liquicolor» или аналогичного. Планшеты инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение не менее 20 мин.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 492 нм.

В качестве раствора сравнения используют стандартный раствор глюкозы с концентрацией 5,55 ммоль/л (100 мг %), входящий в состав готового энзимо-хромогенного набора.

Концентрацию глюкозы (с) в крови рассчитывают по формуле:

где A – оптическая плотность пробы;

A – оптическая плотность глюкозы в растворе сравнения.

Примечание. Величина ОЦУ зависит от радиуса ротора центрифуги и скорости его вращения. Скорость вращения ν (об/мин) для обеспечения необходимой величины ОЦУ (в данном случае 1500 g) вычисляют по следующей формуле:

Активность испытуемого препарата инсулина определяют путем

сопоставления его гипогликемического (сахаропонижающего) действия

с гипогликемическим действием стандартного образца инсулина.

Стандартный образец и единица действия инсулина

Стандартный образец инсулина представляет собой препарат

высокоочищенного инсулина, активность которого определена путем

многократного сопоставления с активностью международного стандарта

и составляет не менее 25 ЕД в 1 мг. За единицу действия (ЕД)

принимают специфическую активность количества массы стандартного

образца, эквивалентного по биологическому действию 1 международной

Примечание. Приготовление растворов стандартного образца и

испытуемого препарата инсулина. Точную навеску стандартного

образца инсулина растворяют в растворе хлористоводородной кислоты

(0,003 моль/л) с рН 2,7-3,0, содержащем консервант в такой же

концентрации, как испытуемый препарат.

Срок годности основного раствора стандартного образца инсулина

4 мес при температуре 4 град. С.

Перед опытом основной раствор стандартного образца инсулина

разводят раствором хлористоводородной кислоты (0,003 моль/л) до

концентрации 1 ЕД в 1 мл. Испытуемый препарат инсулина разводят

этим же раствором хлористоводородной кислоты до концентрации 1 ЕД

в 1 мл, исходя из его предполагаемой активности.

Метод определения биологической активности

Определение биологической активности инсулина проводят на

здоровых кроликах массой 2,5-3,5 кг. Животных массой 1,8-2,3 кг

предварительно не менее 14 сут содержат в условиях вивария, где

они получают овес, сено или свежую траву, корнеплоды,

комбинированный корм и воду. По истечении этого срока определяют

чувствительность кроликов к инсулину. Для этого кроликам дважды с

интервалом 7-8 сут после 18 ч голодания вводят подкожно раствор

стандартного образца инсулина из расчета 0,5 ЕД на 1 кг массы тела

животного и определяют величину снижения концентрации сахара в

крови в процентах. Кровь для исследования берут из краевой вены

уха животных до введения инсулина и через 1,5 и 2,5 ч после его

введения (для расчета берут среднюю концентрацию сахара в крови из

двух определений после введения инсулина). Кровь берут в условиях,

не допускающих чрезмерного волнения кроликов. Из опытов исключают

животных с исходной концентрацией сахара в крови ниже и выше

пределов, установленных для используемого метода определения

содержания сахара в крови (ниже 75 мг % и выше 120 мг % для

феррицианидного метода, ниже 52 мг % и выше 94 мг % для

глюкозооксидазного метода), а также тех животных, которые

реагируют на введение инсулина судорогами или у которых снижение

концентрации сахара в крови составляет менее 15% по отношению к

исходной концентрации. Определение биологической активности

инсулина проводят не ранее чем через 7-8 сут после испытания на

Отобранных для опытов кроликов лишают корма (но не воды) на 18

ч, предшествующих введению инсулина. Животных распределяют на две

группы способом случайного выбора (в каждой группе должно быть не

менее 9 кроликов). Непосредственно перед введением инсулина

кроликов взвешивают, и определяют исходную концентрацию сахара в

крови. Кроликам одной группы вводят подкожно по 0,5 ЕД

стандартного образца инсулина (S) на 1 кг массы тела, кроликам

другой группы — такую же дозу испытуемого препарата инсулина (Т).

Через 1,5 и 2,5 ч после введения инсулина у животных снова

определяют концентрацию сахара в крови.

Для каждого кролика рассчитывают снижение концентрации сахара

(X) в крови в процентах по формуле:

где а — исходная концентрация сахара в крови в миллиграмм —

процентах; b — средняя концентрация сахара в крови в миллиграмм —

процентах из двух определений, проведенных через 1,5 и 2,5 ч после

Как и при испытании кроликов на чувствительность к инсулину,

при расчетах не учитывают животных с исходной концентрацией сахара

в крови ниже и выше пределов, установленных для используемого

метода, а также реагирующих на указанную дозу инсулина судорогами

или дающих снижение концентрации сахара в крови менее 15 % по

отношению к исходной концентрации.

Через 3-5 сут на этих же кроликах проводят повторное испытание

с той разницей, что животным из группы, получавшей стандартный

образец инсулина (S), вводят испытуемый препарат инсулина (Т), а

животным группы, получавшей (Т), вводят (S).

Рассчитывают среднюю величину снижения концентрации сахара в

крови на стандартный образец (%S) и на испытуемый препарат (%Т) по

данным всего опыта. Отношение %T / %S выражает относительную

активность (R) испытуемого препарата (Т). Для выражения активности

испытуемого препарата (Т) в ЕД его предполагаемую активность (А)

Пример: при определении биологической активности инсулина для

инъекций с предполагаемой активностью 40 ЕД в 1 мл получили

следующие величины снижения концентрации сахара в крови в

Первая часть испытания Вторая часть испытания

1) высокой лабильности целевого продукта (лекарственного вещества)

2) использования целевого продукта только в инъекционной форме

3) внутриклеточной локализации целевого продукта

4) высокой гидрофильности целевого продукта

177. ИММОБИЛИЗАЦИЯ ЦЕЛЫХ КЛЕТОК ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЕСООБРАЗНА В СЛУЧАЕ ЕСЛИ ЦЕЛЕВОЙ ПРОДУКТ

3) локализован внутри клетки

4) им является биомасса клеток

178. ТЕХНОЛОГИЯ, ОСНОВАННАЯ НА ИММОБИЛИЗАЦИИ БИООБЪЕКТА, УМЕНЬШАЕТ НАЛИЧИЕ В ЛЕКАРСТВЕННОМ ПРЕПАРАТЕ СЛЕДУЮЩИХ ПРИМЕСЕЙ

4) следы органических растворителей

ИММОБИЛИЗОВАННЫХ БИООБЪЕКТАХ, ПЕРЕД ТРАДИЦИОННЫМ ОБУСЛОВЛЕНО

1) меньшими затратами труда

3) многократным использованием биообъекта

4) ускорением производственного процесса

181. АКТИВИРОВАНИЕ НЕРАСТВОРИМОГО НОСИТЕЛЯ НЕОБХОДИМО

1) для усиления включения фермента в гель

2) для повышения сорбции фермента

3) для повышения активности фермента

4) для образования ковалентной связи

182. ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗА КАТАЛИЗИРУЕТ

1) расщепление бета-лактамного кольца

2) расщепление тиазолидинового кольца

3) отщепление бокового радикала при С 6

4) деметилирование тиазолидинового кольца

183. УДАЛЕНИЕ ЛАКТОЗЫ ИЗ МОЛОКА ОСУЩЕСТВЛЯЮТ С ПОМОЩЬЮ ИММОБИЛИЗИРОВАННОГО ФЕРМЕНТА

184. АМИНОАЦЕЛАЗА ИСПОЛЬЗУЕТСЯ

1) при получении полусинтетических пенициллинов

2) при разделении рацематной смеси аминокислот

3) при получении безлактозного молока

4) при получении фруктозных сиропов

185. БЕТА-ГАЛАКТОЗИДАЗА ИСПОЛЬЗУЕТСЯ

1) при получении полусинтетических пенициллинов

2) при разделении рацематной смеси аминокислот

3) при получении безлактозного молока

4) при получении фруктозных сиропов

186. АЛЬФА-АМИЛАЗА В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОМ ПРОИЗВОДСТВЕ ИСПОЛЬЗУЕТСЯ С ЦЕЛЬЮ

3) превращения глюкозы во фруктозу

4) получения безлактозного молока

187. КОГДА НЕРАЦИОНАЛЬНА ИММОБИЛИЗАЦИЯ ЦЕЛЫХ КЛЕТОК ПРОДУЦЕНТОВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ В

1) высокой лабильности целевого продукта

2) использования целевого продукта только в инъекционной форме

3) высокой гидрофильности целевого продукта

4) внутриклеточной локализации целевого продукта

188. В КАКОМ СЛУЧАЕ ИММОБИЛИЗАЦИЯ ЦЕЛЫХ КЛЕТОК ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЕСООБРАЗНА ЕСЛИ ЦЕЛЕВОЙ ПРОДУКТ

2) локализован внутри клетки

3) им является биомасса клеток

190. С ПОМОЩЬЮ КАКОГО ИММОБИЛИЗИРОВАННОГО ФЕРМЕНТА ПРОИСХОДИТ УДАЛЕНИЕ ЛАКТОЗЫ ИЗ МОЛОКА

191. С КАКОЙ ЦЕЛЬЮ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОМ ПРОИЗВОДСТВЕ ИСПОЛЬЗУЕТСЯ АЛЬФА-АМИЛАЗА

2) превращения глюкозы во фруктозу

4) получения безлактозного молока

192. РОЛЬ ВЕКТОРА В ТЕХНОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК ВЫПОЛНЯЮТ

193. ПОНЯТИЕ «ЛИПКИЕ КОНЦЫ» ПРИМЕНИТЕЛЬНО К ТЕХНОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК ОТРАЖАЕТ

1) комплементарность нуклеотидных последовательностей

2) взаимодействие нуклеиновых кислот и гистонов

3) реагирование друг с другом SH — групп с образованием дисульфидных связей

4) гидрофобное взаимодействие липидов

194. СУБСТРАТАМИ РЕСТРИКТАЗ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ

ТЕХНОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК ЯВЛЯЮТСЯ

195. МИШЕНЬЮ ДЛЯ ФИЗИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ МУТАГЕНОВ В КЛЕТКЕ БИООБЪЕКТОВ ЯВЛЯЕТСЯ

1) дезоксирибонуклеиновая кислота

196. РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКОВЫЕ ГОРМОНЫ И ФАКТОРЫ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ИМЕЮТ, ПО СРАВНЕНИЮ С ВЫДЕЛЯЕМЫМИ ИЗ ЖИВОТНОГО СЫРЬЯ, ПРЕИМУЩЕСТВА ЗА СЧЕТ

1) большей биологической активности

3) большей рентабельности и производства

3) 2-х дисульфидных мостиков

4) 3-х дисульфидных мостиков

198. ДЛИТЕЛЬНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТОВ ИНСУЛИНА ЗАВИСИТ ОТ

1) количества ионов инсулина

2) размеров кристаллов инсулина

3) наличие аморфного инсулина

4) количества консерванта нипагина и фенола

199 РОЛЬ ВЕКТОРА В ТЕХНОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК ВЫПОЛНЯЮТ

200. ИНСУЛИН ОБРАЗУЕТ СТОЙКИЕ КОМПЛЕКСЫ С ИОНАМИ

201. ПРОИНСУЛИН — ЭТО БЕЛОК, КОТОРЫЙ СОСТОИТ ИЗ

2) из 84-х аминокислотных остатков

3) из инсулина и инсулиноподобных белков

202. ПРЕИМУЩЕСТВОМ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ИНСУЛИНА ЯВЛЯЕТСЯ

203. МОЛЕКУЛА ИНСУЛИНА СВИНЕЙ ОТЛИЧАЕТСЯ ОТ МОЛЕКУЛЫ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНСУЛИНА СЛЕДУЮЩИМИ ПАРАМЕТРАМИ

3) наличием дисульфидных мостиков

4) количеством полипептидных цепей

204. ЧТО ЯВЛЯЕТСЯ СУБСТРАТАМИ РЕСТРИКТАЗ (В ТЕХНОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК)

205. ЗА СЧЕТ ЧЕГО ИМЕЮТ ПРЕИМУЩЕСТВО РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКОВЫЕ ГОРМОНЫ И ФАКТОРЫ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПО СРАВНЕНИЮ С ВЫДЕЛЯЕМЫМИ ИЗ ЖИВОТНОГО СЫРЬЯ

2) большей биологической активности

4) большей рентабельности и производства

206. ДЛИТЕЛЬНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТОВ ИНСУЛИНА ЗАВИСИТ ОТ

1) количества ионов инсулина

2) наличие аморфного инсулина

3) размеров кристаллов инсулина

4) количества консерванта нипагина и фенола

207. ЧТО ОТРАЖАЕТ ПОНЯТИЕ «ЛИПКИЕ КОНЦЫ» ПРИМЕНИТЕЛЬНО К ТЕХНОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК

1) взаимодействие нуклеиновых кислот и гистонов

2) реагирование друг с другом SH — групп с образованием дисульфидных связей

3) комплементарность нуклеотидных последовательностей

4) гидрофобное взаимодействие липидов

208. ЧТО ЯВЛЯЕТСЯ МИШЕНЬЮ ДЛЯ ФИЗИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ МУТАГЕНОВ В КЛЕТКЕ БИООБЪЕКТОВ

3) дезоксирибонуклеиновая кислота

209. АКТИВНОСТЬ СУБСТАНЦИИ ИНСУЛИНА ОПРЕДЕЛЯЮТ

210. ЧЕМ ОТЛИЧАЕТСЯ МОЛЕКУЛА ИНСУЛИНА СВИНЕЙ ОТ МОЛЕКУЛЫ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНСУЛИНА

2) наличием дисульфидных мостиков

211. МОНОКОМПОНЕНТНЫЙ ИНСУЛИН ПОЛУЧАЮТ МЕТОДОМ

2) ионообменной хроматографии

3) гидрофобной хроматографии

212. МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ ГЕНА ИНСУЛИНА

2) ферментативный на основе мРНК

3) выделение из генома рестриктазой

213. ИНСУЛИН СТАНДАРТИЗИРУЮТ ПО

2) гипогликемическому эффекту

3) повышению артериального давления

4) гипергликемическому эффекту

214. МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ ГЕНА СОМАТОТРОПИНА

2) ферментативный на основе мРНК

3) выделение из генома рестриктазой

215. АКТИВНОСТЬ СОМАТОТРОПИНА ОПРЕДЕЛЯЮТ

216. ОСНОВНОЕ ПРЕИМУЩЕСТВО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ ПО СРАВНЕНИЮ С БАКТЕРИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ

1) возможность поверхностного культивирования

2) способность осуществлять модификацию белков

4) устойчивость к вирусной инфекции

217. РОЛЬ ВЕКТОРА В ТЕХНОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК ВЫПОЛНЯЮТ

218. МОНОПИКОВЫЙ ИНСУЛИН СОДЕРЖИТ НЕЗНАЧИТЕЛЬНОЕ КОЛИЧЕСТВО

1) проинсулина и инсулиноподобных белков

2) инсулиноподобных белков

3) белки с молекулярной массой 15000 в количестве 2-5%

4) белки с молекулярной массой от 9000 до 12000 в количестве 4-8%

219. В СОСТАВ АКТИВНОГО ИЛА ВХОДЯТ

220. КИШЕЧНАЯ ПАЛОЧКА КАК РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОДУЦЕНТ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНСУЛИНА ПРОДУЦИРУЕТ

1) человеческий инсулин с правильной укладкой дисульфидных мостиков

2) проинсулин с правильной укладкой дисульфидных мостиков

3) отдельно цепи А и В инсулина

4) продуцирование внеклеточных метаболитов

221. ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ФИРМЫ «ELI LILLY» ОСНОВАНА НА ЭКСПРЕССИИ ГЕНА

1) в клетки кишечной палочки

2) в клетки пекарских дрожжей

3) в культуру клеток растений

222. АКТРАФАН НМ ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ

2) препарат рекомбинантного человеческого инсулина двухфазного действия, произведенный по технологии фирмы Novo

3) препарат рекомбинантного человеческого инсулина двухфазного действия, произведенный по технологии фирмы Eli lilly

4) препарат рекомбинантного человеческого инсулина ультракороткого действия, произведенный по технологии фирмы Novo

223. ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ФИРМЫ «NOVO NORDISK» (ДАНИЯ) ОСНОВАНА НА ЭКСПРЕСИИ ГЕНА

1) в клетки кишечной палочки

2) в клетки пекарских дрожжей

3) в культуру клеток растений

4) в культу клеток животных

224. ЧТО ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ АКТРАФАН НМ

2) препарат рекомбинантного человеческого инсулина двухфазного действия, произведенный по технологии фирмы Eli lilly

3) препарат рекомбинантного человеческого инсулина ультракороткого действия, произведенный по технологии фирмы Novo

4) препарат рекомбинантного человеческого инсулина двухфазного действия, произведенный по технологии фирмы Novo

225. ЧТО СОДЕРЖИТ МОНОПИКОВЫЙ ИНСУЛИН В НЕЗНАЧИТЕЛЬНОМ КОЛИЧЕСТВЕ

1) инсулиноподобных белков

2) белки с молекулярной массой 15000 в количестве 2-5%

3) проинсулина и инсулиноподобных белков

4) белки с молекулярной массой от 9000 до 12000 в количестве 4-8%

226. ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ФИРМЫ «ELI LILLY» ОСНОВАНА НА ЭКСПРЕССИИ ГЕНА

1) в клетки кишечной палочки

2) в клетки пекарских дрожжей

3) в культуру клеток растений

4) в культу клеток животных

227. ПРИ ОЧИСТКЕ СТОКОВ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ ПРИМЕНЯЮТ АКТИВНЫЙ ИЛ — ЭТО

1) природный комплекс микроорганизмов

4) смесь микроорганизмов, полученных генноинженерными методами

228. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА СТОЧНЫХ ВОД ОСНОВАНА

1) на способности микроорганизмов на минерализации органических веществ

2) на химическом окислении органических веществ

3) на сжигании органических веществ в токе кислорода

4) на окисление органических веществ под действием хлора

229. АППАРАТЫ, В КОТОРЫХ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ ДЕСТРУКЦИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ СТОЧНЫХ ВОД, НАЗЫВАЕТСЯ

230. АКТИВНЫЙ ИЛ, ПРИМЕНЯЕМЫЙ ПРИ ОЧИСТКЕ СТОКОВ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ — ЭТО

3) смесь микроорганизмов, полученных генноинженерными методами

4) природный комплекс микроорганизмов

231. КАК НАЗЫВАЮТСЯ АППАРАТЫ, В КОТОРЫХ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ ДЕСТРУКЦИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ СТОЧНЫХ ВОД

232. ПРИ ОЧИСТКЕ ПРОМЫШЛЕННЫХ СТОКОВ В «ЧАСЫ ПИК» ПРИМЕНЯЮТ ШТАММЫ-ДЕСТРУКТАТОРЫ

1) природные микроорганизмы

2) постоянные компоненты активного ила

3) стабильные генно-инженерные штаммы

4) не стабильные генно-инженерные штаммы

233. В СОСТАВ АКТИВНОГО ИЛА ВХОДЯТ

234. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА СТОЧНЫХ ВОД ОСНОВАНА

1) на химическом окислении органических веществ

2) на способности микроорганизмов на минерализации органических веществ

3) на сжигании органических веществ в токе кислорода

4) на окисление органических веществ под действием хлора

235. ОКОНЧАТЕЛЬНОЙ ОЧИСТКОЙ ИНСУЛИНА В ПРОМЫШЛЕННОМ ПРОИЗВОДСТВЕ ЯВЛЯЕТСЯ ОПЕРАЦИЯ

1) ионообменной хроматографии

2) кристаллизацией в присутствии солей цинка

3) кристаллизацией в присутствии ионов натрия

236. E. СOLI В КАЧЕСТВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ПРОДУЦЕНТА ИНСУЛИНА ИСПОЛЬЗУЮТ БЛАГОДАРЯ

2) способности к сплайсингу

3) способности образовывать дисульфидные связи

4) способности депонировать цепи А и В инсулина внутри клеток

237. В МОЛЕКУЛЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНСУЛИНА, В ОТЛИЧИИ ОТ СВИНОГО, В 30-М ПОЛОЖЕНИИ Β-ЦЕПИ НАХОДИТСЯ

Содержимое (Table of Contents)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Биологические испытания ОФС.1.2.4.0001.15

инсулина Взамен ОФС 42-0009-02

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на лекарственные средства, стандартные образцы и аналоги инсулина.

Биологические методы испытания инсулина основаны на сопоставлении гипогликемического (сахаропонижающего) действия испытуемого препарата (ИП) с гипогликемическим действием стандартного образца (СО) инсулина или соответствующих СО его аналогов. Биологические методы используют для определения следующих показателей качества:

– биологическая активность (раздел 1);

– пролонгированное действие (раздел 3).

Биологические испытания инсулина и его аналогов отражают их терапевтическое действие. Показатель «Биологическая активность» позволяет количественно определять содержание гипогликемического действующего вещества. Данное определение может проводиться для аттестации СО инсулина при отработке новых производственных технологий для оценки качества и в ходе проверки стабильности в процессе установления срока годности (раздел 1).

Показатель «Биоидентичность» используется для подтверждения подлинности лекарственных средств инсулина или его аналогов по наличию у них гипогликемического действия (раздел 2).

«Пролонгированное действие» – показатель качества лекарственных препаратов инсулина удлиненного действия и их аналогов, который характеризует продолжительность гипогликемического эффекта во времени. Данный показатель является обязательным для всех пролонгированных препаратов и аналогов инсулина (раздел 3).

СО для биологических испытаний представляет собой активное вещество (инсулин человека, инсулин свиной, инсулин крупного рогатого скота, аналоги инсулина), обладающее гипогликемическим действием с указанием точной величины биологической активности, выраженной в международных единицах действия (МЕ) в пересчете на сухое вещество.

Допускается многократное использование животных для биологических испытаний лекарственных средств и аналогов инсулина: кроликов – не ранее чем через 2 недели, мышей не ранее чем через 1 неделю после проведения предыдущего испытания.

1.Приготовление основных растворов СО и ИП. Для проведения биологических испытаний готовят основной раствор СО инсулина или его аналога.

Точную навеску СО инсулина растворяют в соответствующем объеме растворителя для получения концентрации 100 МЕ/мл. В качестве растворителя применяют 0,9 % раствор натрия хлорида для инъекций, подкисленный 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты до рН 2,5–3,5. В фармакопейных статьях на аналоги инсулина могут быть указаны другие растворители.

Основной раствор следует хранить при температуре от 2 до 8 °С. Замораживание не допускается. Можно использовать только прозрачный раствор.

При определении биологической активности субстанции инсулина основной раствор ИП готовят таким же образом, что и основной раствор СО. Разведение субстанции проводят, исходя из величины биологической активности инсулина с учетом фактического содержания влаги.

  1. Приготовление рабочих растворов СО и ИП. Рабочие растворы СО и ИП готовят из основных растворов непосредственно перед испытанием, добавляя соответствующие объемы растворителя до получения требуемых концентраций. В качестве растворителя применяют 0,9 %раствор натрия хлорида для инъекций, подкисленный 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты до рН 2,5 – 3,5.

При определении биологической активности лекарственных препаратов инсулина пролонгированного действия, представляющих собой суспензии, ИП осторожно взбалтывают и отбирают 1,0 мл, к которому для полного растворения суспензии добавляют 0,2 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты. Таким образом, если исходная концентрация ИП равна100 МЕ/мл, то полученный раствор ИП будет иметь концентрацию 83,3 МЕ/мл. В дальнейшем полученный раствор используют для приготовления рабочих растворов ИП.

Основные и рабочие растворы аналогов инсулина готовят, как указано в фармакопейных статьях.

Биологическую активность субстанций инсулина, его лекарственных форм и аналогов определяют одним из 2 методов по снижению концентрации глюкозы в крови:

Метод определения биологической активности инсулина и его аналогов по снижению концентрации глюкозы в крови кроликов (метод А)

Испытания проводят на кроликах породы Шиншилла, массой тела от 2,5 кг. В опыте используют не менее 24 кроликов. Животных содержат на стандартном рационе с соблюдением санитарных правил. За 18 – 20 ч до эксперимента животных лишают корма, а перед началом испытания убирают воду.

Непосредственно перед экспериментом из основных растворов СО и ИП готовят по 2 рабочих раствора (см. Общие положения примечания 1 и 2). В зависимости от чувствительности животных рекомендуемые концентрации рабочих растворов СО для лекарственных средств инсулина – 1,0 и 2,0 МЕ/мл, а для аналогов инсулина – в диапазоне 1,0 – 4,0 МЕ/мл.

Животных распределяют на 4 равные группы способом случайного отбора. Каждая группа животных получает рабочие растворы СО и ИП в порядке, предусмотренном схемой двойного перекреста (табл.). Первой и второй группе животных подкожно вводят рабочие растворы СО в объеме 0,5 мл на животное (малая – s1 и большая – s2 дозы СО), а третьей и четвертой группе – такой же объем рабочих растворов ИП (малая – u1 и большая – u2 дозы). Вторую постановку теста («перекрест») проводят не менее чем через неделю после первой.

Таблица – Схема двойного перекреста (последовательность введения рабочих растворов животным)

Испытание Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4
I постановка (день I) s1 s2 u1 u2
II постановка (день II) u2 u1 s2 s1

Взятие крови осуществляют трижды: непосредственно перед введением испытуемых растворов и через 1 и 2,5 ч после инъекции препарата. Примерно 50 мкл крови из краевой вены уха собирают в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл, содержащую 10 мкл раствора гепарина (5000 МЕ/мл).

Концентрацию глюкозы в крови животных определяют согласно разделу 4. Устанавливают среднюю величину, на которую снижается концентрация глюкозы в крови через 1 и 2,5 ч после введения рабочего раствора СО и ИП инсулина у каждого животного и выражают ее в процентах по отношению к исходной.

Из опыта исключают животных, которые отвечают судорогами на введение инсулина и тех, у которых снижение концентрации глюкозы в крови составляет менее 15 % по отношению к исходному уровню.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу 3.6 «Обработка результатов двойного перекреста (на примере биологической активности инсулина методом А и В)» ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Метод определения биологической активности инсулина по снижению концентрации глюкозы в крови мышей (метод B)

В опыт берут не менее 40 мышей-самок массой тела 20 – 28 г. Животных распределяют на 4 равные группы способом случайного отбора и метят (нумеруют) по порядку каждую особь внутри группы. Мышей содержат на стандартном рационе вивария с соблюдением санитарных правил. До и во время опыта животным должен быть обеспечен свободный доступ к корму и воде.

Непосредственно перед экспериментом из основных растворов СО и ИП готовят по 2 рабочих раствора (см. Общие положения, примечания 1, 2). Концентрация рабочих растворов должна находиться в диапазоне 0,06 – 1,2 МЕ/мл. Для аналогов инсулина возможно применение других концентраций. Большая доза рабочих растворов СО и ИП должна превышать малую не менее чем в 2 раза.

Согласно схеме двойного перекреста (табл.), мышам первой и второй группы подкожно в холку вводят рабочие растворы СО, а третьей и четвертой – такие же объемы рабочих растворов ИП по 0,1 мл/10 г массы тела животного. Рабочие растворы вводят каждому животному последовательно, в соответствии с нумерацией, через каждые 15 – 20 с. Так, например, на введение раствора группе из 12 животных необходимо 3 – 4 мин. Интервал между введениями рабочих растворов каждой группе животных должен составлять 1 – 2 мин.

После инъекции инсулина через (40 ± 1) мин последовательно в соответствии с номером каждого животного внутри группы из орбитального венозного синуса глаза осуществляют взятие около 50 мкл крови с помощью стерильного гепаринизированного капилляра. Необходимо соблюдать те же временные интервалы, что и при введении растворов. Пробы крови помещают в микроцентрифужные пробирки объемом 0,5 мл. Определение концентрации глюкозы в крови животных проводят согласно разделу 4.

Вторую постановку эксперимента (перекрест) проводят через 24 ч после первой.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу 3.6 «Обработка результатов двойного перекреста (на примере биологической активности инсулина методом А и В)», описанному в ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Если в фармакопейной статье даны иные указания, то следуют им.

Определение биоидентичности представляет собой вариант метода определения биологической активности инсулина и его аналогов, подтверждающий подлинность препарата с использованием минимального количества животных. Испытание проводят аналогично разделу 1 (метод А или B) со следующими изменениями:

  1. В опыт берут 8 кроликов по 2 в каждой группе (метод А) или 20 мышей по 5 в каждой группе (метод B).
  2. Не вычисляют доверительные границы величины биологической активности, так как используемое количество животных не позволяет провести статистическую обработку результатов. Метод является полуколичественным.

Препарат считают прошедшим испытание, если его биологическая активность составляет не менее 56 % от ожидаемой.

Если в фармакопейной статье даны иные указания, то следуют им.

Используют кроликов одного пола массой не менее 2,5 кг, которых содержат на стандартном рационе вивария. В опыт берут не менее 18 животных, которых способом случайного отбора распределяют на 2 равные группы. За 18–20 ч до исследования кроликов лишают корма, а перед опытом убирают воду.

Животным подкожно вводят одинаковую дозу основного раствора СО или неразведенного ИП (см. Общие положения примечание 1). Рекомендуемый диапазон доз составляет 0,5 – 0,8 МЕ/кг. Взятие крови проводят непосредственно перед инъекцией, а также через 1,5; 3,0; 4,5 и 6,0 ч после нее. Процедура взятия крови описана в разделе 1 (метод А). Определение концентрации глюкозы в крови животных проводят согласно разделу 4.

За контрольную временную точку принимают момент времени, при котором через 4,5 – 6 ч после инъекции средняя концентрация глюкозы в крови животных, получивших основной раствор СО, приблизится к 100 ± 15 % от исходного уровня. В этой точке для каждого кролика рассчитывают индивидуальную концентрацию глюкозы в крови в процентах относительно исходного уровня для данного животного.

Испытуемый препарат считают прошедшим испытание, если в контрольной временной точке у животных, получивших ИП, средняя относительная концентрация глюкозы в крови, рассчитанная из индивидуальных концентраций, достоверно ниже, чем у животных, получивших основной раствор СО. Достоверность различия проверяют с помощью критерия Стьюдента при доверительной вероятности Р = 0,95.

Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу 3.8 «Обработка результатов испытания на пролонгированное (удлиненное) действие лекарственных препаратов инсулина и его аналогов» ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами».

Для определения концентрации глюкозы в плазме кроликов и мышей рекомендуется применять глюкозооксидазный метод с использованием многоканального фотоэлектроколориметра.

После каждого взятия крови пробы центрифугируют в течение 5 мин при температуре 5 о С и при величине относительного центробежного ускорения (ОЦУ), равной 1500 g (см. Примечание). От каждой пробы отбирают по 10 мкл плазмы и переносят в микрокювету плоскодонного 96-луночного планшета. Планшет с пробами можно хранить при температуре от 6 до 8 0 Сдо окончания испытания.

Перед измерением в каждую микрокювету с плазмой добавляют по 240 мкл реактива готового энзимо-хромогенного набора, например «GLUCOSE Liquicolor» или аналогичного. Планшеты инкубируют при температуре (37 ± 1) °С в течение не менее 20 мин.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 492 нм.

В качестве раствора сравнения используют стандартный раствор глюкозы с концентрацией 5,55 ммоль/л (100 мг %), входящий в состав готового энзимо-хромогенного набора.

Концентрацию глюкозы (с) в крови рассчитывают по формуле:

где A – оптическая плотность пробы;

A – оптическая плотность глюкозы в растворе сравнения.

Примечание. Величина ОЦУ зависит от радиуса ротора центрифуги и скорости его вращения. Скорость вращения ν (об/мин) для обеспечения необходимой величины ОЦУ (в данном случае 1500 g) вычисляют по следующей формуле:

(21), (22) Заявка: 2008140687/13, 15.10.2008

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
15.10.2008

(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: WO 2005016974 A1, 24.02.2005. WO 2008012540 A1, 31.01.2008. WO 2006090119 A1, 31.08.2006. RU 2281756 C2, 10.05.2006.

Адрес для переписки:
117997, Москва, ГСП-7, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, ИБХ РАН, патентный отдел

(72) Автор(ы):
Безуглов Владимир Виленович (RU),
Грецкая Наталья Михайловна (RU),
Бобров Михаил Юрьевич (RU),
Акимов Михаил Геннадиевич (RU),
Баирамашвили Дмитрий Ильич (RU),
Шибанова Елена Дмитриевна (RU),
Клинов Дмитрий Владимирович (RU),
Мирошников Анатолий Иванович (RU)

(73) Патентообладатель(и):
Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Российская Федерация, от имени которой выступает Федеральное агентство по науке и инновациям (RU)

(54) КОМПЛЕКС БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА С ПОЛИСИАЛОВОЙ КИСЛОТОЙ

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению белковых комплексов, и может быть использовано в медицине. Получают комплекс биологически активного рекомбинантного белка, нековалентно связанного с активированной в водном растворе при рН 4,4-4,7 полисиаловой кислотой, обладающий продолжительным терапевтическим действием, общей формулы:

где m=20-110; n=1-4; Р-биологически активный рекомбинантный белок. Изобретение позволяет получить комплекс биологически активного рекомбинантного белка с полисиаловой кислотой, обладающий стабильностью и пролонгированным действием. 2 табл., 6 ил.

Изобретение относится к области биохимии и может найти применение в медицине при получении биологически активных рекомбинантных белков, обладающих стабильностью и пролонгированным действием, имеющих терапевтическое значение, таких как инсулин человека, альфа- и бета-интерфероны, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор и др.

Для повышения устойчивости рекомбинантных белков в составе готовых лекарственных форм используют различные приемы: от ковалентной модификации белков низкомолекулярными и высокомолекулярными агентами до создания комплексов с биополимерами.

Известен способ приготовления препаратов инсулина пролонгированного действия в виде суспензии, образующейся в результате взаимодействия инсулина с протамин-сульфатом. При этом формируются кристаллы в растворе, содержащие в своем составе сам инсулин, протамина сульфат, ионы двухвалентного цинка и фенол. Препарат обладает пролонгированным действием за счет медленного растворения кристаллов в подкожной клетчатке и пролонгированным поступлением свободного инсулина в кровь. Это обеспечивает поддержание уровня глюкозы в крови на протяжении 12-16 часов после подкожного введения препарата протамина-инсулина (Патент РФ 2281756, МПК А61К 9/10, опубл. 2006).

Недостатками полученной пролонгированной формы препарата инсулина являются:

а) необходимость получения кристаллической суспензии, содержащей чужеродный для организма человека белок протамина сульфат;

б) сложность дозирования препарата при введении из-за неоднородности фазового состояния (суспензия кристаллов в растворе).

Известен способ стабилизации биологически активных белков с помощью комплексообразования с природными полисахаридами и аминокислотами (R.S.Brody, S.Alavattam, W.M.Fountain, R.L.Jones. Stabilization of biologically active proteins with mixtures of polysacchar/> 3), а боковые цепи из олигогалоктопиранозных звеньев присоединены связью (1 6). В состав молекул данного полисахарида входят также другие моносахаридные остатки, присоединенные к основной и боковой цепям. Гуммиарабик содержит также около 1% сильногликозилированных белков, таких как оксидазы и пероксидазы, активность которых необходимо дезактивировать перед соединением с белками, для предотвращения нежелательных побочных реакций с функциональными группами белка.

Недостатками получаемых по этому способу соединений являются: а) содержание примесей сильно гликозилированных белков вследствие использования смеси природных полисахаридов, которые практически невозможно отделить от полисахаридов; б) возможные нежелательные иммунные реакции пациентов на примесные белки и иммуногенные полисахариды; в) невозможность стандартизации готового белкового препарата из-за трудностей контроля состава сложных природных смесей. Известен наиболее близкий к заявленному комплекс генно-инженерных белков с сульфатированными полисахаридами (Y.Uemura, Н.Arimura, Н.Morise, S.Funakoshi, Т.Suyama. Process for recovering interferon. US 4314935). Комплекс получают путем взаимодействия раствора интерферона, произведенного клетками человека, с полисахаридом, содержащим отрицательно заряженные сульфогруппы. В качестве полисихарида используют бентонит или SP-сефадекс. Образующийся комплекс нерастворим в воде. При этом белок остается нативным и может быть отделен в виде данного комплекса от других примесей.

Однако данный способ не предназначен для приготовления растворимых в воде комплексов полимерных отрицательно заряженных углеводов с рекомбинантными белками.

Изобретение решает задачу расширения ассортимента стабильных, растворимых в воде биологически активных рекомбинантных белков с пролонгированным действием.

Поставленная задача решается за счет стабильного комплекса биологически активного рекомбинантного белка с полисиаловой кислотой, обладающего продолжительным терапевтическим действием, общей формулы:

где: m=20-110; n=1-4; Р — биологически активный рекомбинантный белок.

Полисиаловая кислота — природный биополимер, входящий в состав молекул адгезии нервных клеток млекопитающих и являющийся компонентом клеточной стенки некоторых бактерий (Gregoriadis G., McCormack В., Wang Z. et al. // FEBS Lett. 1993. V.315. P.271). Она не обладает иммуногенностью, узнается сиалидазами организма, расщепляющими ее до остатков нейраминовой кислоты, и выводится из организма. Полисиаловую кислоту используют для ковалентной модификации белков (S.Jain, Р.Laing, G.Gregoriadis, D.H.Hreczuk-Hrist, Y.P.apaoannou. Sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation. WO 2005016974), но нековалентные комплексы этой кислоты с белками, являющиеся предметом данного изобретения, не известны.

Комплекс полисиаловой кислоты с белками получают смешением растворов каждого из компонентов при определенном значении рН, обычно ниже 6.0, перемешиванием в течение некоторого времени с последующим доведением рН до определенных для данной лекарственной формы значений, обычно 7.4. Полисиаловую кислоту перед введением в состав комплекса активируют, подкислением ее водного раствора с последующим разделением на сефадексе G25. В отдельных случаях активацию полисиаловой кислоты проводят непосредственно перед приготовлением комплекса без стадии фильтрации через колонку с сефадексом. Полученные комплексы полисиаловой кислоты и белка могут храниться как в растворе, так и в виде лиофильно высушенного кристаллического препарата. Образование комплекса полисиаловая кислота-белок может быть зарегистрировано прямыми наблюдениями с помощью атомно-силового микроскопа. Пролонгированное действие рекомбинантных белков в составе комплекса с полисиаловой кислотой подтверждается данными биологических испытаний in vivo. Сохранение специфической биологической активности белка в комплексе с полисиаловой кислотой следует из данных экспериментов на культурах клеток, чувствительных к данным белкам. Повышение стабильности белковой молекулы к действию природных веществ, индуцирующих агрегацию, продемонстрировано специальным экспериментом.

Таким образом, заявляемое изобретение решает задачу повышения стабильности и длительности фармакологического действия генно-инженерных белков путем их введения в состав нековалентного комплекса с природной полисиаловой кислотой.

Изобретение иллюстрируют графические материалы.

Фиг.1. АСМ-изображение комплексов инсулина с полисиаловой кислотой. Масштаб 60 нм. А — молекулы инсулина.

Фиг.2. Электрофореграмма разделения в полиакриламидном геле. Полиакриламидный гель, неденатурирующие условия, без концентрирующего геля, рН 8.8, 8%Т, окрашивание EZBlue (Сигма, США). 1 — нативный интерферон , 2 — комплекс из примера 7, 3 — нативный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, 4 — комплекс из примера 6, 5-7 — маркеры молекулярной массы, 5 — карбангидраза, 6 — -лактоглобулин, 7 — БСА.

Фиг.3. Электрофореграмма инсулина и его комплекса с полисиаловой кислотой после инкубации с арахидоноилдофаминхиноном (AA-DAQ). Полиакриламидный гель, денатурирующие условия без восстановления, Трициновый буфер. 1 — комплекс инсулина с полисиаловой кислотой из примера 2, 2 — комплекс инсулина с полисиаловой кислотой из примера 2+AA-DAQ, 3 — инсулин + AA-DAQ, М — маркер.

Фиг.4. Влияние препаратов интерферона-альфа 26 на пролиферацию клеток линии Daudi. 1 — комплекс интерферона и полисиаловой кислоты 22 кДа, полученный, как указано в примере 5,2, стандартный образец интерферона альфа 2в.

Фиг.5. Влияние препаратов гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (ГКСФ) на пролиферацию клеток HL60, дифференцированных диметилсульфоксидом. 1 — препарат сравнения филграстим, 2 — комплекс ГКСФ и полисиаловой кислоты 22 кДа, полученный в примере 6.

Фиг.6. Влияние препаратов интерферона-бета 1б на пролиферацию клеток линии Daudi. 1 — комплекс интерферона и полисиаловой кислоты 22 кДа, полученный как указано в примере 7, 2, стандартный образец интерферона бета 1б.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1. Получение активированной полисиаловой кислоты.

К 110 мг полисиаловой кислоты 22 кДа (m=75) прибавляют 1.72 мл воды и перемешивают при комнатной температуре (23°С) 15 мин, измеряют рН. Значение 7.0. Прибавляют 70 мкл 0.5 М HCl, результирующий рН раствора 4.5. Колонку PD-10, заполненную сефадексом G25 (GE Healthcare, Англия), промывают водой, детектируя элюат при 240 нм. Наносят раствор полисиаловой кислоты и продолжают элюировать водой. Собирают фракции по поглощению при 240 нм. Основное вещество выходит в первой фракции, рН раствора 4.9. Эту фракцию (3.9 мл) переносят в круглодонную колбу и лиофилизуют. Получают 86 мг сухого кристаллического вещества. Хранят при температуре ниже -18°С.

Пример 2. Получение комплекса полисиаловой кислоты (m=50) с инсулином.

В сосуд с магнитной мешалкой помещают 250 мг полисиаловой кислоты с массой 15 кДа (m=50) и растворяют в 5 мл воды при перемешивании. Измеряют значение рН полученного раствора (обычно находится в пределах 6.5-5.5) и дотитровывают раствор до значения 4.5 0.5 М HCl. Одновременно приготавливают раствор субстанции генно-инженерного инсулина человека из 96 мг полипептида и 4 мл воды при рН 2.0. К полученному прозрачному раствору полисиаловой кислоты прибавляют при постоянном перемешивании порциями раствор инсулина в воде. Немедленно образуется объемный белый осадок. Перемешивают при комнатной температуре (23°С) 30 мин и доводят рН раствора до значения 6.75-7.0. Полученный раствор стерильно фильтруют через фильтр с диаметром пор 0.22 мкм и лиофилизуют. Получают 300 мг белого кристаллического вещества. Соотношение полисиаловая кислота — белок 1:1 (n=1).

Пример 3. Получение комплекса полисиаловой кислоты (m=20) с инсулином.

В сосуд с магнитной мешалкой помещают 250 мг полисиаловой кислоты с массой 6 кДа (m=20) и растворяют в 5 мл воды при перемешивании. Измеряют значение рН полученного раствора (обычно находится в пределах 6.5-5.5) и дотитровывают раствор до значения 4.5 0.5 М HCl. Одновременно приготавливают раствор субстанции генно-инженерного инсулина человека из 60 мг полипептида и 3 мл воды при рН 2.0. К полученному прозрачному раствору полисиаловой кислоты прибавляют при постоянном перемешивании порциями раствор инсулина в воде. Перемешивают при комнатной температуре (23°С) 30 мин и доводят рН раствора до значения 6.75-7.0. Полученный раствор стерильно фильтруют через фильтр с диаметром пор 0.22 мкм и лиофилизуют. Получают 280 мг белого кристаллического вещества. Соотношение полисиаловая кислота — белок 4:1 (n=4).

Пример 4. Получение комплекса полисиаловой кислоты (m=110) с инсулином.

В сосуд с магнитной мешалкой помещают 456 мг полисиаловой кислоты с массой 32 кДа (m=110) и растворяют в 9 мл воды при перемешивании. Измеряют значение рН полученного раствора (обычно находится в пределах 7.3-6.5) и дотитровывают раствор до значения 4.5±0.1 0.5 М HCl. Одновременно приготавливают раствор субстанции генно-инженерного инсулина человека из 73 мг полипептида и 3.2 мл воды при рН 2.0. К полученному прозрачному раствору полисиаловой кислоты прибавляют при постоянном перемешивании порциями раствор инсулина в воде. Немедленно образуется объемный белый осадок. Перемешивают при комнатной температуре (23°С) 30 мин и доводят рН раствора до значения 7.15±0.1. Полученный раствор стерильно фильтруют через Millex фильтр 0.22 мкм и лиофилизуют. Получают 495 мг белого кристаллического вещества. Соотношение полисиаловая кислота — белок 1:1 (n=1).

Пример 5. Получение комплекса полисиаловой кислоты с интерфероном альфа 2б.

457 мг активированной полисиаловой кислоты 22 кДа, полученной, как описано в примере 1, растворяют в 75 мл очищенной воды. Перемешивают при комнатной температуре (23-25°С) до полного растворения. Проверяют значение рН. В случае необходимости дотировывают 0.5 М раствором соляной кислоты до значения 4.6±0.1 под контролем рН-метра. К полученному раствору при перемешивании со скоростью 300±50 оборотов в минуту приливают 100 мл раствора белка с концентрацией интерферона 2±0.1 мг в мл, полученного на стадии перемешивают при комнатной температуре 30 мин. Доводят рН до значения 7.0 0.1 N NaOH и стерильно фильтруют. Соотношение полисиаловая кислота — белок 2:1.

Пример 6. Получение комплекса гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (ГКСФ) и полисиаловой кислоты.

Получают раствор комплекса ГКСФ и активированной полисиаловой кислоты 22 кДа, как описано в примере 4, из 745 мг полисиаловой кислоты и 28 мл раствора белка с концентрацией ГКСФ 9 мг в мл. Полученный раствор комплекса количественно вводят в хроматографическую колонку PD-50, заполненную сефадексом G50 (GE Healthcare, Англия). Колонку промывают не менее чем тремя объемами фосфатно-солевого буфера, рН 7.4. Контроль элюата осуществляют по нарастанию поглощения при 240 нм с помощью УФ-детектора. Фракции, соответствующие фронту, вершине и основной спадающей части пика собирают в полиэтиленовые пробирки на 15 мл. Фракции, предшествующие пику вещества, а также соответствующие его хвостовой части, отбрасывают. Измеряют объем раствора комплекса ГКСФ с полисиаловой кислотой после гель-хроматографии. Отбирают пробу 500 мкл для анализа содержания белка. По данным анализа рассчитывают количество фосфатно-солевого буфера (рН 7.4), которое требуется для получения концентрации 0.54-0.66 мг/мл и добавляют к раствору комплекса. Полученный раствор субстанции стерилизуют, пропуская через стерилизующий фильтр в асептических условиях. Соотношение полисиаловая кислота — белок 2:1.

Пример 7. Получение комплекса полисиаловой кислоты с интерфероном бета-1б.

В флакон из темного стекла на 4.5 мл помещают 2 мл готового раствора интерферона, содержащего 0.89 мг/мл белка в 10 мМ фосфатном буфере (рН 7.3), содержащем 2% маннита. К данному раствору при перемешивании при комнатной температуре (20°С) прибавляют одной порцией раствор полисиаловой кислоты 22 кДа с концентрацией 27 мг/мл (рН 4.6). Перемешивают при этой температуре 35 мин. Дотитровывают до значения 7.2 0.1 М NaOH. Полученный раствор перемешивают 30 мин при комнатной температуре. Определяют концентрацию белка. При необходимости разбавляют 10 мМ фосфатным буфером (рН 7.3) до концентрации 0.25 мг/мл. Стерильно фильтруют. Соотношение полисиаловая кислота — белок 3:1.

Пример 8. Визуализация комплекса полисиаловой кислоты и инсулина человека с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ).

На поверхность свежесколотого высокоориентированного пиролитического графита (ВОПГ) наносят 40 мкл раствора-модификатора графита «GM» фирмы «Нанотюнинг» (Россия). После 10 мин инкубации каплю сдувают сжатым аргоном. На подготовленную таким образом поверхность ВОПГ наносят каплю водного раствора комплексов инсулин-полисиаловая кислота, полученного в примере 2 с концентрацией 0,1 мкг/мл. После инкубации в течение 5 мин каплю сдувают сжатым аргоном. АСМ-изображнения получены в прерывисто-контактном режиме с использованием сверхострых кантилеверов высокого разрешения производства «Нанотюнинг» (Россия) на приборе Solver Р-47 bio фирмы «НТ-МДТ» (Россия).

На фиг.1 представлены типичные АСМ-изображения комплексов инсулина с полисиаловой кислотой. Молекулы полисиаловой кислоты выглядят на АСМ-изображениях хорошо расправленными. Стрелками на фиг.1 указаны молекулы инсулина, имеющие большую высоту по сравнению с молекулами полисиаловой кислоты. Измеряемая в АСМ высота молекул полисиаловой кислоты — 0,3-0,5 нм, средняя длинна молекул — около 10-20 нм, что соответствует молекулярному весу 23 кД, с учетом сокращения длины молекулы за счет образования спиральных участков и изгибов. Взаимодействие носит специфичный характер, так как молекулы инсулина распределены неравномерно по всей длине молекулы полисиаловой кислоты и связаны преимущественно с одним из концов молекулы. Высота молекул инсулина, измеряемая при помощи АСМ, соответствует 0,7-1 нм.

Пример 9. Характеристика комплексов белков с полисиаловой кислотой с помощью электрофореза в полиактиламидном геле в неденатурирующих условиях.

Разделение проводят без концентрирующего геля, рН 8.8, 8%Т, окрашивание EZBlue (Сигма, США).

На фиг.2 показана типичная электрофореграмма комплексов белков с полисиаловой кислотой 22 кДа, полученных, как описано в примерах 6 и 7. Видно, что подвижность комплексов отличается от подвижности нативного белка.

Пример 10. Устойчивость комплексов рекомбинантных белков с полисиаловой кислотой к действию модифицирующих агентов.

Окисленная форма нейротрансмиттера дофамина (n-этиламино-о-бензохинон) предполагается в качестве повреждающего агента при болезни Паркинсона, причем известно, что она способна образовывать ковалентные аддукты с остатками цистеина и лизина различных белков. Для проверки устойчивости генно-инженерных белков в комплексе с полисиаловой кислотой к действию дофаминхинона используют его жирно-кислотное производное (арахидоноилдофаминхинон, AA-DAQ), обладающее большей стабильностью в водных растворах по сравнению с немодифицированным дофаминхиноном. Рекомбинантные белки (КСФ, интерфероны альфа 2б и бета 1б, а также инсулин) и их комплексы с полисиаловой кислотой инкубируют с пятикратным молярным избытком (относительно суммарной концентрации лизинов и аргининов) AA-DAQ при рН 7.4 или 6.5 в течение часа при 37°С и анализируют методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле в невосстанавливающих условиях. В отсутствие полисиаловой кислоты инкубация указанных белков в с AA-DAQ приводят к образованию олигомеров белков. Доминирующим продуктом является димер, за ним следуют тример и незначительное количество тетрамера. Комплексообразование с полисиаловой кислотой существенно снижает образование олигомеров. На фиг.3 представлена электрофореграмма типичного эксперимента с инсулином и его комплексом с полисиаловой кислотой. Электрофоретическое разделение проводили в денатурирующих условиях без восстановления с использованием Трицинового буфера согласно опубликованной методике (Judd R.C. Electrophoresis of Peptides // Methods in Molecular Biology. V. 32 Basic Protein and Peptide Protocols, Humana Press, 1994). Видно практически полное отсутствие олигомерных форм белка в образце, содержащем комплекс с полисиаловой кислотой.

Пример 11. Испытание биологической активности препарата инсулина на кроликах.

Биологическую активность и пролонгированное действие препарата определяют по снижению содержания глюкозы в крови у кроликов.

Используют кроликов одного пола массой 2.5÷3.5 кг, содержащихся на стандартном рационе вивария. В опыт берут не менее 18 животных, которых способом случайного отбора распределяют на две равные группы. Одной группе подкожно вводят неразведенный ИП (испытуемый препарат), другой группе — такую же дозу основного раствора СО (стандартного образца растворимого инсулина), соответствующей видовой специфичности. Рекомендуемый диапазон доз составляет 0.5÷0.8 МЕ/кг. Взятие крови из ушной вены кролика проводят непосредственно перед инъекцией и через 1.5; 3.0; 4.5 и 6.0 ч после нее. Определение содержания глюкозы в сыворотке крови проводят глюкозоксидазным методом с использованием набора «Глюкоза» (Human, Германия).

За контрольную временную точку принимают момент времени, когда средняя концентрация глюкозы в крови животных, получивших основной раствор СО, вернулась к исходному уровню (100%). В этой точке для каждого кролика, получившего СО или ИП, рассчитывают индивидуальную относительную концентрацию глюкозы в крови в процентах от исходного уровня у данного животного. Если за 6 ч средняя концентрация глюкозы в крови кроликов, получивших СО, не вернулась к исходному уровню, то в качестве контрольной временной точки принимают момент времени, в который средний уровень глюкозы в данной группе максимально приблизился к исходному.

ИП считают прошедшим испытание, если в контрольной временной точке средняя относительная концентрация глюкозы в крови животных, получивших ИП, рассчитанная из индивидуальных относительных концентраций, достоверно ниже, чем в крови животных, получивших основной раствор СО. Достоверность различия проверяют с помощью критерия Стьюдента при p Таблица 1 Испытание биологической активности комплекса инсулина с полисиаловой кислотой на кроликах Описание образца % снижения глюкозы через промежуток времени, ч 1.5 3 45 6 СО (Стандартный образец инсулина), 40 МЕ/мл 37 21 ИП (Комплекс инсулина с полисиаловой кислотой из примера 2), 40 МЕ/мл 43 30 18 21

Пример 12. Испытание биологической активности препарата инсулина на мышах.

Биологическую активность и пролонгированное действие препарата определяют по снижению содержания глюкозы в крови у мышей.

В опыт берут не менее 30 мышей с отклонением массы тела не более ±1.0 г. Мышей распределяют на 3 равные группы способом случайного отбора и метят по порядку каждую особь внутри группы.

Животным первой группы через каждые 15 секунд подкожно в холку вводят рабочий раствор стандартного образца (СО), приготовленный из основного раствора СО, в объеме 0,1 мл/10 г массы тела животного. Рабочий раствор СО готовят непосредственно перед экспериментом в концентрации 0,1 МЕ/мл.

Животным второй группы вводят рабочий раствор испытуемого препарата (ИП), в объеме 0,1 мл/10 г массы тела. Рабочий раствор ИП готовят аналогичным образом, непосредственно перед экспериментом, с концентрацией 0,1 МЕ/мл.

Временной интервал между введением каждого рабочего раствора должен составлять не менее двух минут.

Третьей (контрольной) группе вводят раствор, не содержащий инсулин (плацебо), в том же объеме и по той же схеме, что и опытным животным.

Взятие крови (около 50 мкл) проводят из орбитального венозного синуса с помощью стерильного гепаринизированного капилляра или пастеровской пипетки через 40±1 мин, 90±2 мин и 120±3 мин после инъекции инсулина в соответствии с номером каждого животного внутри группы, соблюдая те же временные интервалы, что и при введении растворов. Определение содержания глюкозы в сыворотке крови проводят глюкозоксидазным методом с использованием набора «Глюкоза» (Human, Германия). Рассчитывают среднее содержание глюкозы в крови у мышей каждой из трех групп в каждой временной точке. Определяют разность между средней концентрацией глюкозы в крови животных третьей, контрольной группы и средней концентрацией глюкозы в крови первой (получившей раствор СО) и второй (получившей раствор ИП) групп. Тест считается удовлетворительным, если полученные значения статистически значимы (р Таблица 2 Испытание биологической активности комплекса инсулина с полисиаловой кислотой на мышах Описание образца % снижения глюкозы через промежуток времени, мин 40 90 120 180 Контрольный раствор (плацебо) СО (стандартный образец инсулина), 40 МЕ/мл 62 31 6 ИП (Комплекс инсулина с полисиаловой кислотой из примера 2), 40 МЕ/мл 68 38 32 27

Пример 13. Испытание биологической активности комплекса интерферона альфа 2б человека и полисиаловой кислоты на клеточных культурах.

Биологическая активность рекомбинантного интерферона альфа 2б человека в составе нековалентного нанокомплекса с полисиаловой кислотой определяют по способности этого препарата подавлять пролиферацию клеточной линии Дауди, полученной из лимфомы Беркита и являющейся стандартной моделью изучения антипролиферативного эффекта препаратов группы интерферонов.

Аликвоты растворов комплекса интерферона альфа 2б человека и полисиаловой кислоты 22 кДа, полученного, как указано в примере 5, и препарата сравнения в фосфатно-солевом буфере прибавляют к культуральной среде ARPMI 1640 с клетками Дауди с таким расчетом, чтобы конечная концентрация белка составила от 0.064 до 250 нг на мл среды. Клетки инкубируют с веществами в течение 72 часов. По истечении указанного срока определяют число жизнеспособных клеток в каждой пробе по сравнению с интактной клеточной линией. Каждый тест воспроизводят не менее пяти раз.

После инкубации определяли число жизнеспособных клеток с использованием колориметрического МТТ-анализа. Учет результатов по 3-4 измерениям для каждой концентрации каждого препарата производят по относительному количеству клеток линии Дауди в МТТ-тесте через 72 ч после внесения образцов.

Как видно из фиг.4, комплекс интерферона и полисиаловой кислоты оказывают стойкий антипролиферативный эффект, наблюдаемый при концентрации выше 1 нг/мл и полностью сопоставимый с таковым у стандартного препарата интерферона, что подтверждается и статистически по отсутствию достоверных различий между результатами испытаний.

Пример. 14. Испытание биологической активности комплекса гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (ГКСФ) человека и полисиаловой кислоты на клеточных культурах.

Испытание препарата комплекса рекомбинантного ГКСФ человека и полисиаловой кислоты 22 кДа проводят аналогично примеру 13, с тем отличием, что вместо клеток линии Daudi используют клетки линии миелоидной лейкемии человека — HL60, дифференцированные диметилсульфоксидом. Препаратом сравнения в данном случае выступало официальное лекарственное средство на основе рекомбинантного ГКСФ — Филграстим. Действие каждой навески препарата изучают при 3-кратном определении при том, что эксперимент воспроизводят трижды. Результаты пролиферативного действия испытуемых препаратов представлены на фиг.5.

На чертеже видно, что ГКСФ в составе нековалентного нанокомплекса с полисиаловой кислотой в полной мере обеспечивает пролиферативный эффект в отношении клеток миелоидного ростка кроветворения и при концентрации в культуральной среде выше 0.4 нг/мл не уступает в этом отношении официальному лекарственному средству.

Пример. 15. Испытание биологической активности комплекса интерферона бета 1б и полисиаловой кислоты на клеточных культурах.

Испытание препарата комплекса рекомбинантного интерферона бета 1б человека и полисиаловой кислоты 22 кДа проводят аналогично примеру 13. Препаратом сравнения являлся нативный интерферона бета 1б. Действие каждой навески препарата изучают при 3-кратном определении, при том, что эксперимент воспроизводят трижды. Результаты антипролиферативного действия испытуемых препаратов представлены на фиг.6.

Как видно из фиг.6, комплекс интерферона и полисиаловой кислоты оказывает стойкий антипролиферативный эффект, наблюдаемый при концентрации выше 10 нг/мл и полностью сопоставимый с таковым у стандартного препарата интерферона, что подтверждается и статистически по отсутствию достоверных различий между результатами испытаний.

Стабильный комплекс биологически активного рекомбинантного белка, нековалентно связанного с активированной в водном растворе при рН 4,4-4,7 полисиаловой кислотой, обладающий продолжительным терапевтическим действием, общей формулы:

где m=20-110; n=1-4; Р — биологически активный рекомбинантный белок.

Как предотвратить инсульт головного мозга у мужчин и женщин — профилактические меры и лекарственные средства

Грамотно организованная профилактика инсульта позволяет снизить давление, которое воздействует на каждый сосуд, нормализовать питание мозга и предотвратить развитие большого количества сердечно-сосудистых заболеваний. Ради здоровья свой образ жизни придется кардинально изменить! Однако, благодаря такой практике, риск возникновения ишемического инсульта удастся снизить примерно на 50%!

По своей природе инсульт – это острое нарушение кровоснабжения мозга, на фоне которого происходит полная или частичная гибель нервных клеток. Причинами такого явления могут быть:

  • блокирование кровеносного сосуда бляшкой, тромбом и т.д.;
  • разрыв сосуда.

После того, как пораженные нервные клетки отмирают, организмом автоматически утрачивается и функция, за которую они отвечали (речь, координация движений и т.д.). Больной (при условии адекватной терапии и отсутствии сопутствующих хронических заболеваний) имеет шансы выздороветь, однако реабилитация длится долго: от нескольких месяцев до нескольких лет.

Зафиксировав даже незначительные изменения в состоянии здоровья или поражение одной из ее систем, нужно сразу приступать к комплексному лечению. Меры профилактики инсульта заключаются в исключении из жизни всех факторов, способных спровоцировать данное заболевание. Основные профилактические мероприятия:

  • Отказ от вредных привычек. Курение крайне негативно воздействует на все системы организма. Тем же, кто планирует прожить долгую и счастливую жизнь, следует отказаться от сигарет раз и навсегда.
  • Коррекция веса. Лишние килограммы – это существенная нагрузка на сердечно-сосудистую систему, повышающая риск возникновения инсульта. Небольшой избыток допускается, однако он должен составлять не более 30%.
  • Регулирование уровня холестерина. Регулярное употребление вредных продуктов из фаст-фуда провоцирует закупоривание сосудов и дополнительную нагрузку на сердце. В результате этого нарушаются кровообращение и метаболический процесс, с последующим возникновением инсульта.
  • Нормализация артериального давления. Этот фактор зависит от огромного количества процессов, протекающих в организме. Проблему нужно решать, пока она находится в зародыше, ведь долго выдержать возросшую нагрузку не слишком эластичные сосуды уже не могут.
  • Своевременное лечение сопутствующих заболеваний. Диабет, гипертоническая болезнь и даже хронические проблемы с ЖКТ в конечном итоге могут привести к инсульту.

Возраст является основной причиной, чтобы задуматься о собственном здоровье и понять, как избежать инсульта у женщин. Примерно после 45 лет стоит проходить плановое обследование у врача и принимать препараты, разжижающие кровь. Своеобразными катализаторами к инсульту могут стать: длительный бесконтрольный прием оральных контрацептивов, период климакса, гормональные перестройки организма. В это время поддерживать сердечную мышцу соответствующими препаратами нужно обязательно.

Инсульт ранее поражал людей в возрасте от 60 лет, но сегодня болезнь значительно помолодела. Такой диагноз ставится относительно молодым пациентам, которым едва исполнилось 30 лет.

Основными причинами такой болезни выступают неправильный образ жизни, регулярные стрессы, переутомление и общее истощение. Первыми признаками инсульта выступают сильные головные боли, утомляемость, нарушения артериального давления. Но многие не обращают на них внимания, что приводит к ухудшению здоровья, развитию опасных осложнений.

Для профилактики инсульта необходимо начинать следить за состоянием здоровья с молодого возраста. Это касается не только обращения к врачу при первых признаках проблемы, но и соблюдение лечебных мероприятий, отказ от вредных привычек. Обнаружение первых симптомов дает возможность вовремя начать терапию инсульта, предупредить кровоизлияние головного мозга и сохранить здоровье.

Главной причиной заболевания у женщин является нарушение общего кровоснабжения тканей головного мозга, на фоне которого начинают гибнуть клетки. Такое явление сопровождается очаговой и общей неврологической симптоматикой. После инсульта у больного также отмечаются многочисленные нарушения, включая паралич, парез, вестибулярные и речевые нарушения, проблемы с социальной адаптацией. Для устранения или снижения негативных последствий таких нарушений необходим целый комплекс мер против инсульта, включая медикаментозную профилактику осложнений.

Терапия инсульта может быть назначена только после проведения ряда диагностических мероприятий. Это магнитно-резонансная и компьютерная томография, холтеровский мониторинг давления. Следует исключить такие факторы риска заболеваемости, как метаболические, поведенческие и вызывающие. К метаболическим факторам относятся:

  • диабет на любой стадии;
  • артериальная гипертензия (инсульт головного мозга развивается на фоне этого синдрома);
  • дислипидемия, то есть нарушение количества липидов различной плотности;
  • нарушения обмена веществ;
  • нарушения свертываемости крови.

Вызывающие факторы инсульта – это генетическая (наследственная) склонность к заболеванию. Поэтому желательно с молодого возраста больше внимания уделять своему здоровью. Надо избегать стрессов, переутомлений, исключить вредные привычки.

К поведенческим факторам инсульта, которые могут стать причиной болезни, относятся:

  • ожирение (заболеваемость велика особенно на фоне диабета);
  • курение;
  • злоупотребление спиртным;
  • злоупотребление некоторыми средствами, например, оральными контрацептивами;
  • депрессии, частые стрессы, хроническая усталость (по статистике диагностируется в молодом возрасте при таких нарушениях);
  • гиподинамия;
  • употребление продуктов с высоким содержанием холестерина, животных жиров;
  • нарушения режима питания.

Методики по устранению этих факторов наряду с приемом ряда медикаментов находится в основе профилактики патологии инсульта. Но начинать надо, как можно раньше, при первых признаках посетив врача. Это даст возможность избежать серьезных осложнений.

Чтобы предупредить инсульт головного мозга, следует сначала понять механизм и особенности развития патологии, причины, основные симптомы болезни. Геморрагический и ишемический инсульты – самые частые виды проблемы. При ишемической форме происходит закупоривание сосуда сгустком крови, при этом тромб постепенно двигается по направлению к мозгу. Основной причиной инсульта является увеличение количества в крови жировых бляшек, то есть развивается атеросклероз.

При геморрагическом инсульте наблюдается кровоизлияние головного мозга, причиной которого выступает слабость сосудистых стенок. При разрыве кровь попадает в ткани, наблюдается их серьезное повреждение. Микро инсульт – это состояние, при котором нарушение занимает всего пару секунд, стимулятором такого явления становится временная закупорка сосудов в результате спазма.

Основными признаками надвигающейся проблемы с сосудами выступают следующие симптомы:

  • чувство потери равновесия;
  • потеря сознания;
  • нарушения зрения, его полное отсутствие в одном глазу или временная расфокусировка;
  • онемение, проявляющееся в одной стороне тела;
  • нарушения речи или полная ее потеря;
  • головокружения;
  • частые головные боли;
  • общая слабость.

При первых же признаках инсульта следует обратиться к врачу, который назначит ряд обследований. По их результатам выбирается тип терапии, медикаменты, определяется необходимость хирургии. Если установлен диагноз «повреждение сосудов», врач назначает дополнительные исследования, прописывает терапию, соответствующую общему состоянию больного, выявленным нарушениям.

Такого состояния можно избежать, если вовремя начать внедрять ряд мер, включая терапию. Это касается таких простых мероприятий, как правильное питание, увеличение физической активности, исключение вредных привычек. Следует избегать стрессов, нервных потрясений и переутомлений, больше бывать на свежем воздухе. Визит к врачу откладывать нельзя, рекомендуется регулярно посещать его для осмотра, точного соблюдения всех назначений. Очень важным является точное выяснение причины кризиса, ее исключение.

Чтобы предотвратить развитие инсульта, также надо учитывать основные факторы его развития. Наиболее часто отмечаются гипертоническая болезнь, атеросклероз церебральных сосудов, патология сосудов мозга, злокачественная гипертония. Врачи назначают проведение первичной и вторичной профилактики по таким основным направлениям:

  • выявление первичной артериальной гипертензии или гипертонии, своевременное предотвращение болезни;
  • предотвращение развития ишемического инсульта, терапия сосудистых патологий, болезней сердца;
  • устранение нарушений мозгового кровообращения, особенно это важно для больных с транзиторными ишемическими атаками, после проведенного хирургического вмешательства;
  • исключение первичных нарушений инсульта, мозгового кровообращения;
  • устранение нарушений обмена веществ для больных, страдающих ишемической болезнью сердца, сосудистыми патологиями, поражениями артерий.

Такие меры позволяют предотвратить инсульт, исключить развитие серьезных осложнений и патологий. Мероприятия могут включать в себя прием ряда лекарственных средств, терапию первопричины патологии, улучшение качества жизни.

Чаще всего кровоизлияние развивается на фоне происходящих изменений в стенках сосудов, что сопровождается повышенным артериальным давлением, нарушениями сердечного ритма, патологиями сердечных клапанов. По этой причине после проведенной диагностики назначают разные виды препаратов, направленных на устранение первопричины. Также терапия включает в себя устранение инфекционно-воспалительных процессов, заболеваний ряда внутренних органов.

Все действия были четкими и быстрыми, при первых же признаках следует обратиться к врачу и провести диагностику, начать терапию. Основными направлениями терапии поражения мозга являются нормализация функций дыхательной, сердечно-сосудистой систем, снижение отечности. Но точный комплекс медикаментозных средств зависит от общего состояния организма и первопричины болезни. Если больной находится в бессознательном состоянии или его состояние неадекватное, показана срочная госпитализация с введением медикаментов капельно или струйно.

Чтобы предотвратить ухудшения при образовании бляшек в сосудах, прописывают статины. Такие виды препаратов снижают общий уровень липидов, устраняют отложения холестерина и снижают количество бляшек в сосудах. Это позволяет снизить риск развития ишемического инсульта, дает возможность контролировать уровень давления. Одновременно с этим назначают такие лекарства, как:

  • блокаторы кальциевых каналов;
  • ингибиторы АПФ;
  • диуретики;
  • блокаторы рецепторов ангиотензина II.

Чаще всего патология развивается у женщин в возрасте 18-40 лет. Связано это с длительным приемом оральных контрацептивов, стрессами и переутомлением, патологическим течением беременности, расстройствах гормональной системы. У мужчин ишемический инсульт диагностируется реже, чаще всего он связан с переутомлением или частыми стрессами, болезнями сердечно-сосудистой системы. Инсульт может также развиваться на фоне прогрессирующей патологи сосудов, спазмов, которые сопровождаются длительными, сильными головными болями.

Профилактика заболевания обычно включает в себя следующие методы:

  • полный отказ от вредных привычек, включая спиртное, курение, злоупотребление кофе;
  • контроль уровня артериального давления (при необходимости надо принимать гипотензивные лекарства), прописанные врачом;
  • правильное питание;
  • от инсульта эффективен правильный образ жизни, увеличение уровня физических нагрузок, прогулки пешком;
  • терапия гормональных нарушений, устранение причин, которые их вызвали;
  • консультации с эндокринологом, подбор других контрацептивов с более низким содержанием гормонов.

Вторичная профилактика представляет собой комплекс предупреждающих мер. Они направлены на устранение причин нарушений кровообращения, исключение негативных последствий такой патологии. Чтобы предотвратить инсульт, необходимо соблюдать все рекомендации врача, вовремя принимать прописанные медикаменты. Кроме медикаментозной терапии могут назначаться альтернативные методы, включая диету, лечебную физкультуру.

Чаще всего в рамках терапии и профилактики кровоизлияния прописывают такие средства:

  • гипотензивные средства;
  • назначение препаратов против образования тромбов, включая антиагреганты, антикоагулянты и прочие.

Для предотвращения инфаркта могут быть прописаны тиклопидин, дипиридамол, клопидогрель, аспирин. Средства для гипотензивной терапии подбираются индивидуально, в некоторых случаях проводится каротидная эндатерэктомия, то есть хирургическое вмешательство. Группа антикоагулянтов состоит из гепарина, надропарина, дальтопарина и прочих. Основанием запрета приема лекарств выступают болезни печени и почек.

Инсульт вызывается различными факторам. К не контролируемым относятся следующие:

  • генетический фактор;
  • возраст (у пожилых людей диагностируется чаще);
  • пол (по статистике чаще всего инсульт поражает мужчин).

К контролируемым факторам кровоизлияния при инсульте относятся:

  • гипертоническая болезнь (повышение давления от 160/90 мм рт. ст повышает вероятность в 4 раза, от 200/110 мм рт. ст. – в 10 раз);
  • заболеваемость выше у пациентов, страдающих патологиями сердца, в том числе, мерцательной аритмией, склонных к образованию тромбов;
  • сахарный диабет (повышает вероятность заболевания в 3-5 раз, что связано с нарушениями работы щитовидки, развитием атеросклероза;
  • высокий уровень «плохого» холестерина, липидов низкой плотности, что вызывает развитие атеросклероза, повышая вероятность кровоизлияния;
  • злоупотребление спиртным, курением повышает риск развития сосудистых патологий, появление тромбов, атеросклероза сонной артерии.

Чтобы избежать инсульта, во многих случаях достаточно исключить такие контролируемые факторы или вести к минимум их негативные последствия. Например, следует отказаться от курения, неправильного питания и спиртного. Вероятность заболевания инсультом можно снизить. Надо контролировать вес, заниматься профилактикой сердечно-сосудистых болезней, диабета. Рекомендуется исключить психические, эмоциональные напряжения, стрессы, переутомление. Надо больше бывать на открытом воздухе, начать заниматься лечебной гимнастикой, больше времени ходить пешком.

Наименование метода борьбы Терапия Ограничения к методам борьбы Эффективность
Реабилитация после инсультов Метод биологической обратной связи предполагает компьютерный контроль над инсультом, восстановление управляемости телом. Пациент после инсульта учится заново управлять движением мышц на платформах. Лечение проводится при подключенных датчиках и с отображением всех движений на мониторе Применяется только для больных, сохранивших способность к нормальному обучению (мозг поражен инсультом не очень сильно) До 85%
Реабилитация после инсульта Электростимуляция при ходьбе предполагает активизацию мышц, восстановление их сокращения при движении Применяется только после острого периода, в остальных случаях подобные методы лечения результативность не показывают. Противопоказано при болезнях сердца До 70-80%
Реабилитация Лечебная физкультура в водной среде, восстановление функций ходьбы в бассейне при инфаркте. Вода разбавляется сложным комплексном рапа в виде смеси солей, жирных кислот, витаминов, аминокислот, полисахаридов. Метод при инфаркте позволяет восстановить кровообращение, обмен веществ, движение лимфы, оказывает обезболивающее, противовоспалительное действие Методы борьбы с последствиями не назначаются при плохой переносимости водной среды, невозможности контролировать действия До 65%
Терапия Кинезитерапия, проводимая в условиях невесомости. Петлевой метод восстанавливает мышечный тонус, функции суставов Назначается в рамках восстановительной терапии, на фоне приема лекарств. Требует повторных сеансов До 60%
Терапия, реабилитация после инсульта Транскраниальная электростимуляция при помощи электрических, магнитных импульсов. Только после кровоизлияния До 55%

Если патология уже диагностирована, надо сразу начать терапию для борьбы с проблемой. Для этого применяются различные методы, включая такие, как использование препаратов из стволовых клеток. Это восстанавливает поврежденные мозговые ткани, но возможность подобного лечения определяет только врач. В некоторых случаях для избавления от инсульта рекомендовано хирургическое вмешательство. Оперативным путем удаляются сгустки крови из сосудов, что снижает уровень внутричерепного давления, снижает общее давление. Но хирургия возможна не всегда, такие методы борьбы противопоказаны для больных в возрасте от 70 лет, при наличии онкологических заболеваний, диабета, почечной недостаточности.

Для терапии прописывают различные типы препаратов, но кроме лекарств могут быть рекомендованы народные методы. Они являются дополнительными, позволяющими поддерживать работу сосудов. К таким способам относятся питье отваров на сосновых шишках, применение травяных настоек. Это позволяет активировать восстановление тканей в мозгу, нормализовать давление, укрепить сосудистые стенки и предупредить инсульт. Но полностью заменить медицинские меры такие средства не могут, устранение патологии при инсульте должно быть комплексным.

Но наиболее результативным методом остается хирургия и регулярное наблюдение у врача. Избавиться от инсульта можно, если проверяться у врача с указанной периодичностью, проходить обследование. Частоту посещения при инсульте и необходимость консультаций у смежных врачей определяет только наблюдающий врач, он же направляет пациента для выполнения таких исследований:

  • ЭКГ для выявления инсульта, болезней сердца;
  • общий анализ крови для определения риска образования тромбов;
  • биохимия крови для анализа липидного профиля, уровня содержания глюкозы, «плохого холестерина».

Назначаются коагулограмма, суточное мониторирование давления, определение уровня свертываемости крови, консультации у офтальмолога. Осмотр глазного дна позволяет выявить гипертоническую ангиопатию и инсульт на ранней стадии. Такое исследование играет большую роль в случае, когда пациент не контролирует артериальное давление. Также этот симптом важен, если гипертонии нет, то есть больной не отмечал наличия повышенного давления.

Предотвращение инсульта – это комплексные меры. По результатам исследований наблюдающий специалист назначит прием медикаментов, даст рекомендации по питанию и физическим нагрузкам. При необходимости будет проведено хирургическое вмешательство для снижения внутричерепного давления, удаления кровяных сгустков, которые выступают причиной осложнений. Обнаружение проблемы позволяет вовремя начать профилактику, предупредить кровоизлияние и сохранить здоровье.

Первичная профилактика инсульта заключается в выявлении у пациента факторов риска. Если они относятся к неизменяемым, то показано углубленное обследование. Коррекция образа жизни и прием медикаментов помогает повлиять на большинство модифицируемых причин.

После инсульта проводится наблюдение у специалистов и профилактические курсы лечения. Основу вторичной профилактики составляет контроль за артериальным давлением, содержанием холестерина в крови и состоянием свертывающей системы.

К неизменяемым факторам риска инсульта относятся: пожилой возраст, мужской пол, недоношенность и гипотрофия (низкий вес) при рождении, а также генетическая предрасположенность. На эти причины невозможно влиять, но их учет помогает выделить группу лиц, которой показано полное обследование сосудов головного мозга. Оно проводится не реже одного раза в три года даже при отсутствии неврологической симптоматики.

К модифицируемым причинам нарушения мозгового кровотока относятся:

  • артериальная гипертония;
  • никотиновая и алкогольная зависимость;
  • избыток холестерина в крови;
  • сахарный диабет;
  • стенокардия, мерцание предсердий, сужение сонных артерий;
  • нарушение структуры гемоглобина (серповидно-клеточная деформация эритроцитов);
  • использование гормональной заместительной терапии при климаксе или прием противозачаточных препаратов;
  • систематическое пренебрежение правилами питания;
  • низкий уровень физической активности;
  • ожирение.

Стенокардия — одна из причин инсульта

В зоне повышенного риска находится каждый пациент, который имеет любой их этих факторов, если же есть два и более, то опасность возрастает в геометрической прогрессии.

А здесь подробнее об атеросклерозе сосудов сердца.

Для предотвращения мозговой ишемии или кровоизлияния требуется коррекция модифицируемых причин. При этом изменение образа жизни может полностью устранить главные повреждающие факторы и существенно понизить риск инсульта.

Курение приводит к устойчивому спазму артерий, прогрессированию склеротических изменений. Такие нарушения имеют со временем необратимый характер, поэтому всем пациентам, имеющим этот или еще и другой фактор риска, рекомендуется отказаться от курения для сохранения жизни и трудоспособности. Доказано, что через 2 года после того, как человек бросил курить, его сосуды восстанавливаются, а шансы на развитие инсульта равны некурящим.

Для лечения никотиновой зависимости используют кодирование, сеансы психотерапии и следующие препараты:

  • никотиновые пластыри, жевательная резинка или таблетки для рассасывания, ингаляторы – Никоретте, Никодерм, Никотрол;
  • блокаторы рецепторов к никотину – Чампикс, Табекс;
  • антидепрессанты – Авентил, Велбутрин.

Рацион, снижающий вероятность инсульта, строится на таких принципах:

  • снижение поваренной соли, животных насыщенных жиров, простых углеводов (сахара и муки);
  • большое содержание свежих овощей, ягод и фруктов, молочной продукции и рыбы низкой жирности.

Низкая активность в течение дня приводит к замедлению кровотока и понижает уровень обменных процессов. Профилактической физической нагрузкой считается 30 минут в день пять дней в неделю или полтора часа за 7 дней при повышенной интенсивности занятий.

Для улучшения переносимости тренировок могут быть рекомендованы:

  • Рибоксин;
  • витаминные комплексы (Витрум Энерджи, Супрадин);
  • L-карнитин;
  • Глютаминовая кислота;
  • растительные адаптогены – женьшень, левзея, элеутерококк.

Прием алкоголя становится особенно опасным при регулярном превышении допустимой дозы и употреблении суррогатных напитков. Повышается риск при наличии сопутствующих патологий печени и почек, тормозящих его инактивацию и выведение. Максимальной дозой для мужчин считается 30 г в пересчете на этил не более 4 раз в неделю. Для женщин ее нужно уменьшить в два раза. Медикаменты, понижающие влечение к алкоголю:

  • вызывают отвращение – Эспераль, Тетурам, Колме, Лидевин;
  • снижают желание выпить – Пропротен, Вивитрол;
  • снимают похмелье – Медихронал, Цитраргинин, Зорекс, Глицин.

Гипертония занимает главенствующее положение среди факторов риска. Опасный уровень давления начинается с 140/90 мм рт. ст., при болезнях почек и сахарном диабете он ниже на 10 единиц.

Для снижения показателей требуется коррекция образа жизни и следующие группы препаратов:

  • мочегонные – Арифон, Трифас;
  • альфа-блокаторы – Доксазозин, Эбрантил;
  • бета-блокаторы – Конкор, Небилет;
  • блокаторы кальциевых каналов – Коринфар, Леркамен;
  • ингибиторы ангиотензинконвертирующего фермента – Энап, Престариум;
  • блокаторы ангиотензина – Лориста, Микардис;
  • центрального действия – Метилдопа, Эстулик, Физиотенс.

Для компенсации сахарного диабета назначается терапия инсулином или таблетками (в зависимости от типа). Профилактика инсульта проводится при помощи гипотензивных средств (Лизиноприл, Рами Сандоз), статинов (Липримар, Розарт) или фибратов (Трайкор), Аспирина.

Избыток холестерина в крови (дислипидемия) лечится диетическим питанием и назначением лекарственных средств следующих групп:

  • статины – Вазилип, Роксера;
  • фибраты – Липофен;
  • комбинированные – Инеджи, Кадует.

Если основными препаратами не удается достигнуть нужного уровня холестерина, то могут быть назначены секвестранты желчных кислот (Холестипол), никотиновая кислота, Эзетимиб.

Первичная профилактика при заболеваниях сердца проводится такими препаратами:

  • при пороках сердца, стенокардии и инфаркте – Варфарин;
  • мерцательная аритмия – Аспирин, Клопидогрель и Варфарин;
  • стеноз сонных артерий – хирургическое лечение и последующий прием Аспирина.

Серповидноклеточная анемия лечится переливанием крови, эритроцитарной массы, Гидроксимочевины. Для заместительной терапии в климактерическом периоде у пациенток из групп риска не используют прогестины и эстрогены, особенно вреден Премарин.

Употребление таблетированных контрацептивов повышает опасность инсульта при дополнительных факторах (курение, избыточный вес). Поэтому их назначают совместно с антикоагулянтами или выбирают другой способ предохранения.

Снижение веса при ожирении предусматривает гипокалорийную диету и дозированную физическую нагрузку, лекарственная терапия может быть применена только при неэффективности других мер воздействия (Ксеникал, Меридия).

Смотрите на видео о методах профилактики инсульта:

Вероятность повторного инсульта понижается, если устранены все модифицируемые факторы риска или максимально компенсированы их симптомы. Предотвратить рецидив также помогает регулярный контроль состояния больных и профилактические медикаментозные курсы терапии.

После инсульта пациенты находятся под наблюдением невропатолога, а при сопутствующих заболеваниях показаны консультации эндокринолога, кардиолога, сосудистого хирурга. Обязательные обследования включают:

  • анализ крови общий, липидограмму, коагулограмму;
  • сахар крови, при его повышении тест на толерантность к глюкозе, гликированный гемоглобин;
  • УЗИ сосудов шеи и головы в режиме дуплексного сканирования;
  • ЭКГ, в том числе с функциональными пробами;
  • МРТ или КТ головного мозга;
  • церебральную ангиографию при подозрении (динамическом наблюдении) на расслоение стенок сонных артерий, аневризму, мальформацию, дисплазию фиброзно-мышечного типа, артериит или болезнь Моямоя.

Для углубленного исследования кардиальных факторов риска исследование может быть дополнено:

  • УЗИ и рентгенографией органов грудной клетки;
  • ЭКГ-мониторингом по Холтеру;
  • анализом крови на антифосфолипидные антитела.

Основное внимание после острой ишемии головного мозга направлено на выявление атеросклеротических изменений сосудистого русла, поэтому показаны исследования венечных сосудов, артерий почек, нижних конечностей, а также динамическое наблюдение за показателями свертывающей системы и липидного спектра. Для этого используют методы эхографии, реовазографии, капилляроскопии, ангиографии. Показано применение функциональных диагностических проб.

После кровоизлияния в головной мозг (геморрагического инсульта) главное направление для диагностики – мониторинг уровня артериального давления, ЭКГ, исследование сосудов глазного дна, показана повторная томография для контроля за состоянием мозговой гемодинамики.

Для восстановления основных функций головного мозга и предотвращения распространения зоны повреждения используется комплексная терапия. Основные группы препаратов:

  • нейротрофические (показаны при речевых нарушениях, когнитивной (познавательной) дисфункции, низком уровне психической активности) – Церебролизин, Актовегин, Мексикор, Цитофлавин, Семакс;
  • для улучшения мозгового кровотока – Кавинтон, Агапурин, Билобил;
  • ноотропные – Цераксон, Пирацетам, Фенотропил;
  • при сосудистой деменции – Мема, Глиатилин, Нейромидин;
  • для снятия приступов головокружения – Бетагис;
  • при спастическом состоянии мышц – Баклофен, Сирдалуд;
  • антидепрессанты – Прозак, Анафранил, Ципрамил.

Программа мероприятий для вторичной профилактики рецидива острого нарушения церебральной гемодинамики включает такие направления:

  • стабилизация артериального давления (130 — 140/80 — 90 мм рт. ст.) – ингибиторы АПФ (Каптоприл, Хартил) и мочегонные (Гипотиазид, Тифас);
  • антитромботическая терапия – Варфарин, Ипатон, Плавикс, Аспирин;
  • при низкой свертывающей активности (предупреждение кровоизлияния) – Дицинон, Тренакса;
  • снижение холестерина крови – диета, статины (Роксера, Зокор).

Для профилактики нарушений мозгового кровотока требуется как можно раньше выявить факторы риска и минимизировать их проявления. Для этого пациенты, у которых есть вероятность сосудистых кризов, должны быть полностью обследованы, им рекомендуется скорректировать образ жизни, диету, повысить физическую активность, отказаться от вредных привычек и пройти курсы медикаментозного лечения.

Для того чтобы не было инсульта, необходимо:

  • изменить образ жизни (отказ от курения, алкоголя, достаточный сон, избегать стрессов);
  • правильное питание (сократить жиры животного происхождения, соль, сахар);
  • контролировать артериальное давление, содержание холестерина и глюкозы в крови.

Эти мероприятия относятся к первичной профилактике. После перенесенного инсульта нужны медикаменты:

Группа препаратов Названия
Снижающие холестерин Зокор, Атокор
Разжижающие кровь Плавикс, Аспирин Кардио
Улучшающие мозговой кровоток Сомазина, Танакан, Глицин

Профилактика инсульта бывает первичной – для предупреждения его развития. Она направлена на основные факторы риска (курение, избыток жира в питании, гипертония, сахарный диабет, ожирение). Избежать повторного инсульта помогает вторичная профилактика: применение медикаментов для нормализации давления, кровообращения головного мозга, разжижения крови.

Первичная профилактика развития инсульта головного мозга для женщин и мужчин включает:

  • отказ от курения, сужающего артерии, ухудшающего приток крови к мозговой ткани, для этого используют кодирование, препараты (Никоретте, Чампикс);
  • правильное питание – снижение потребления жирного мяса, поваренной соли и сахара, увеличение приема свежих овощей, ягод, фруктов, кисломолочных напитков, цельнозерновых каш и хлеба, рыбы;
  • ежедневную физическую активность не менее 30 минут – ходьба, плавание, гимнастика;
  • отказ от алкоголя или переход на допустимую дозу 15 г этанола для женщин и 30 г для мужчин не более 4 раз в неделю (примерно 100-200 мл красного сухого вина через день);
  • уменьшение избыточного веса тела при помощи низкокалорийной диеты и увеличения физических нагрузок, при низкой эффективности добавляют Ксеникал, Меридиа или назначают оперативное лечение;
  • нормализацию давления крови – уменьшение соли, крепкого чая и кофе при гипертонии, прием таблеток (Арифон, Престариум, Небилет, Лориста), необходимо поддерживать показатели не выше 140/90 мм рт. ст., избегать резкого снижения.

При высоких уровнях холестерина и сахара нужны более строгие ограничения их поступления с пищей, применение препаратов для нормализации содержания в крови. Так как образование тромбов бывает при повышенной вязкости крови, нарушении работы сердца, то пациентам после инфаркта, с мерцательной аритмией, рекомендуется длительное применение противосвертывающих средств – Варфарин, Плавикс, Кардиомагнил. Они помогают предупредить и ишемический инсульт.

Вторичная профилактика заключается в предупреждении повторного инсульта, поэтому она индивидуализированная – разная программа нужна при ишемическом и геморрагическом. В ней учитывают также все факторы риска (курение, алкоголь, ожирение, гипертония, диабет, болезни сердца), возраст, сопутствующие патологии.

После острого нарушения кровообращения из-за закупорки артерии (ишемии мозга) необходимо:

  • принимать кроворазжижающие средства: при мерцательной аритмии – Варфарин, внесердечном источнике тромба (атеросклероз) – Кардиомагнил, Курантил, Плавикс;
  • снизить холестерин, не допускать повышения липопротеинов низкой плотности до 3 ммоль/л при помощи диеты и статинов (Липримар, Аторвастатин);
  • поддерживать давление крови на уровне 130-140/85-90 мм рт. ст., ежедневно контролировать показатели;
  • регулярно (не реже 1 раза в 3 месяца) проходить осмотр невролога, а при необходимости – окулиста, кардиолога и эндокринолога, ЭКГ, УЗИ сосудов, анализы крови общий, коагулограмму, липидограмму.

После кровоизлияния в головной мозг вторичная профилактика включает:

  • постоянный контроль артериального давления и прием препаратов, не допускающих его повышения (Пренеса, Нимотоп);
  • диагностику – повторная томография для исследования остаточных явлений, ЭЭГ, осмотр глазного дна;
  • лечение болезней, которые могут вызвать повышение давления – сахарный диабет, патологии надпочечников, почек, щитовидной железы, атеросклероз;
  • полный отказ от курения и алкоголя.

На занятиях в школе по профилактике инсульта пациентов обучают составлению правильного рациона, комплекса лечебной гимнастики, измерению давления в домашних условиях, ведению дневника самоконтроля.

Как правильно замерить давление самостоятельно

Для профилактики ОНМК (острого нарушения мозгового кровотока) показана диета по типу средиземноморской с добавлением орехов. Она предусматривает:

  • минимизацию потребления мяса (до 2 раз в неделю), сливок и сливочного масла (до 10 г в день), соли до 3-5 г, сахара (отказ или не более 15 г);
  • отказ от колбас, субпродуктов, сала, кулинарного жира, наваров, алкоголя, крепкого кофе, жареных и острых блюд;
  • в основе рациона – овощи в свежем и отварном виде (500 г, кроме картофеля), фрукты и ягоды (400 г), гречневая, овсяная, перловая каша, хлеб ржаной, с отрубями, отварная, запеченная рыба, морепродукты, нежирный сыр, творог, 30-50 г орехов в день.

В пожилом возрасте особенно сложно подобрать вид физических нагрузок для профилактики инсульта. Недостаток движений считается одним из факторов риска, а пациенты к 55-70 годам имеют обычно ограниченную подвижность из-за болезней сердца, суставов. Поэтому рекомендуется:

  • дыхательная гимнастика, упражнения в положении сидя и лежа при невозможности активных движений;
  • ежедневная утренняя зарядка и ходьба, прогулки на свежем воздухе при удовлетворительном состоянии;
  • плавание, скандинавская ходьба, велотренажер, легкий бег, йога при хорошем самочувствии и достаточной тренированности.

Для того чтобы контролировать свое состояние, необходимо каждый день измерять давление крови. Это поможет избежать как первого, так и повторного инсульта. Замеры проводят по правилам:

  • спустя час после еды, кофе или чая;
  • через 30-45 минут после курения;
  • не менее 10-15 минут нужно находиться в полном покое, нельзя разговаривать и двигаться;
  • рука находится на жесткой поверхности – подлокотник, стол, а спина расслаблена, опирается на спинку кресла, кровати.

Пациентам с болезнями сосудов, сердца, диабетом измерения необходимы дважды в день. Полученные данные записывают в дневник самоконтроля, он должен содержать и сведения о нагрузках, принимаемых медикаментах, питании. Это поможет врачу правильно подобрать дозировку препаратов.

Пример дневника самоконтроля

Предотвратить повторный инсульт возможно при приеме лекарств: снижающих давление, холестерин (статины), Аспирин, Глицин и других средств по назначению врача. Важно учесть и исключить факторы, которые могут вызвать нарушение мозгового кровообращения (резкие перепады давления, приступ аритмии, смена климата, перегревание, прием алкоголя).

Установлено, что чаще всего провоцируют развитие инсульта:

  • гипертония, инфаркт или нарушение кровотока головного мозга у кровных родственников;
  • возраст от 60 лет;
  • мужской пол, у женщин риск возрастает после наступления климакса;
  • низкая двигательная активность;
  • сильный стресс;
  • прием алкоголя;
  • курение;
  • питание с обилием жира и сладостей, недостаток растительной пищи;
  • колебания атмосферного давления, температуры воздуха, перегревание – горячая ванна, сауна, особенно с обезвоживанием;
  • высокое артериальное давление, гипертонический криз, резкое снижение, особенно у пожилых, отсутствие контроля за показателями при гипертонии, прием препаратов только при скачке давления;
  • хронические болезни сосудов, сердца, легких, почек;
  • сахарный диабет;
  • ожирение.

После перенесенного инсульта некоторые препараты рекомендуют для постоянного применения – Аспирин, Глицин, от давления, для снижения холестерина.

Прием аспирина в дозе 1 мг на 1 кг веса тела помогает снизить способность тромбоцитов к соединению в сгустки – тромбы. Это уменьшает риск закупорки сосудов и прекращения поступления крови в ткани головного мозга. Рекомендуется для длительного применения. Чтобы уменьшить раздражение желудка, необходимо использовать специальные формы – Аспирин Кардио, Тромбо Асс, Кардиомагнил.

Смотрите на видео о применении Аспирина в качестве профилактики инсульта:

Глицин рекомендуется для курсового применения – по 1 таблетке 3 раза в день на протяжении 0,5-1 месяца, а также для экстренной профилактики. В последнем случае необходимо принять сразу 10 штук при появлении слабости в руке, ноге, сильной головной боли, нарушении речи, симметрии лица.

Их растирают в порошок и помещают под язык или за щеку. При удовлетворительном состоянии пациент может последовательно рассасывать таблетки. Так повторяют 5 дней, а потом переходят на прием обычной поддерживающей дозы.

Для того чтобы предупредить острое нарушение кровообращения в сердце (инфаркт), головном мозге (инсульт), необходимо контролировать уровень артериального давления при помощи препаратов:

Группа препаратов Названия
Антагонисты кальция Норваск, Нимотоп
Ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента Престариум, Хартил
Мочегонные Трифас, Арифон
Сартаны Лориста, Теветен

Доза и конкретный медикамент подбираются только после обследования, так как каждая группа имеет противопоказания. Применение таблеток от давления должно быть постоянным. Только так можно предотвратить инсульт и инфаркт. Для пожилых пациентов требуется низкая дозировка, потому что снижение давления ними переносится даже хуже, чем повышение.

Статины снижают содержание холестерина в крови, что защищает от развития ишемического инсульта. Это основной механизм их действия, но не единственный. Установлено, что прием Липримара, Крестора, Зокора и аналогов:

  • улучшает состояние сосудистой стенки;
  • предотвращает разрушение клеток свободными радикалами (образуются при недостатке кислорода);
  • снижает свертывание крови;
  • препятствует спазму артерий мозга;
  • предупреждают тромбоз.

Интересно, что другие группы препаратов, снижающих холестерин, не обладают свойствами защиты мозга, поэтому они не назначаются после инсульта.

При первых признаках инсульта (слабость и снижение чувствительности в конечностях, невнятная речь, отставание половины лица при улыбке, дезориентированность) можно принять Аспирин, Глицин, препарат от давления, если оно резко повысилось, но важнее всего немедленно вызывать скорую помощь.

Действия при первых признаках инсульта включают:

  1. вызов скорой помощи;
  2. нужно уложить пациента на кровать или пол (при приступе вне дома), подложив под голову подушку (сложенную одежду);
  3. освободить от сдавливающих элементов – пояс, воротник;
  4. при наличии рвоты повернуть голову набок, очистить ротовую полость для доступа воздуха;
  5. приложить лед к голове.

В отношении медикаментов необходима большая осторожность. Если точно известен диагноз (были ранее подобные приступы – транзиторные ишемические атаки), то можно принять таблетку Аспирина по 100 мг, рассосать 10 таблеток глицина или измельчить их и положить в ротовую полость. При давлении выше 160 мм рт. ст. (верхний показатель) и назначенных ранее препаратах дают не более 1 обычной дозы гипотензивного средства.

  • предлагать лекарства больному, который ранее их не принимал, а приступ возник впервые, крайне опасен Нитроглицерин при инсульте;
  • давать еду и пищу;
  • ждать, когда станет лучше, и медлить с вызовом скорой помощи;
  • оставлять пациента одного, разрешать ему передвигаться.

А здесь подробнее о тромбозе сосудов головного мозга.

После инсульта необходимо наблюдение у невропатолога, регулярное прохождение клинических и инструментальных исследований и прием препаратов для восстановления ткани головного мозга. Все медикаменты принимают строго по рекомендации врача.

Начинать лечение народными средствами можно уже на стадии восстановления после ишемического или геморрагического инсульта. Помогут народные средства против боли, а также ликвидировать последствия инфаркта.

Назначается медикаментозное лечение инсульта для снятия тяжелых проявлений заболевания. При геморрагическом поражении головного мозга или же ишемическом они помогут также предотвратить прогрессирование и нарастание симптомов.

Нередко у пациентов появляется слабость после инсульта. Она может быть очень сильная, ощущаться в ногах, проявляться бессонницей, депрессией. Как восстановиться и что делать больному?

Случается ишемический инсульт у пожилых довольно часто. Последствия после 55 лет крайне тяжелые, восстановление сложное и не всегда успешное, а прогноз не такой уж оптимистичный. Усложняется инсульт головного мозга при наличии сахарного диабета.

Измерять давление после инсульта необходимо каждые пол часа в первые дни. Происходят скачки как после ишемического, так и геморрагического. Опасно как высокое, так и низкое. Таблетки зачастую выписываются на длительный период. Какое должно быть в норме после инсульта?

Реальная угроза жизни — стволовой инсульт. Он может быть геморрагический, ишемический. Симптомы напоминают инфаркт, а также схожи с другими заболеваниями. Лечение длительное, полное восстановление после инсульта стволового мозга практически невозможно.

Больному просто необходим массаж после инсульта. Правильно проведенный, он способствует восстановлению подвижности рук и ног, лица. Как делать в домашних условиях правильно после ишемического и геморрагического?

Правильно проведенная реабилитация после инсульта в домашних условиях помогает скорее вернуться к нормальной жизни. Она включает упражнения в кровати и на тренажерах, для восстановления речи после ишемического и геморрагического инсульта. Также помогут народные рецепты и питание.

Возникает аритмия после инсульта при наличии проблем с сердцем, атеросклеротических бляшек и прочих факторов. Появляется мерцательная аритмия также из-за возвращения к нездоровому образу жизни.

Посттравматический дефект речи, снижение функции восприятия, ухудшение зрения или частичный паралич – это основные осложнения, возникающие при остром нарушении мозгового кровообращения. Избежать таких последствий можно, если ответственно относиться к образу жизни и проводить профилактику инсульта, которая включает медикаментозные и народные методы.

Первичная и вторичная профилактика инсульта заключается в исключении факторов, провоцирующих развитие патологического процесса:

  • табакокурение – повышает риск развития инсульта в 2 раза;
  • частые стрессовые ситуации – депрессия, нервное перенапряжение, повышенная утомляемость и нерегулярный сон;
  • употребление алкогольной и наркотической продукции;
  • ожирение и малоподвижный образ жизни;
  • употребление продуктов с высоким содержанием холестерина.

Главная цель профилактики ишемического инсульта – полное исключение или сведение к минимуму количества провоцирующих причин:

  • откажитесь от вредных привычек;
  • ежедневно гуляйте на свежем воздухе;
  • своевременно лечите атеросклеротический стеноз артерий;
  • следите за АД и при необходимости принимайте препараты, снижающие давление;
  • питайтесь сбалансированно;
  • контролируйте течение хронических заболеваний и не допускайте обострения (аритмия, сахарный диабет, почечная недостаточность).

На развитие патологии влияют факторы, не подлежащие корректировки:

  • возраст после 48–50 лет (риск острого нарушения кровообращения увеличивается с каждым годом);
  • представители сильного пола подвержены большему риску, чем женщины;
  • отягощающий анамнез и предрасположенность.

Профилактика инсульта состоит из комплекса мероприятий по организации здорового образа жизни:

  • контролируйте свое артериальное давление утром и вечером (оптимальные показатели систолического (верхнего) давления должны быть в пределах 110-139 мм рт. ст. При регулярном повышении показателей обратитесь к врачу за назначением медикаментозного лечения;
  • следите за уровнем холестерина, так как его высокое содержание провоцирует склерозирование сосудов;
  • перейдите на здоровое питание — уменьшите потребление соли, увеличьте количество овощей и фруктов. К изменения в рационе переходите постепенно, Избегайте перекусов на ходу и перееданий, особенно сладостями и колбасами;
  • займитесь спортом — умеренные физические нагрузки (езда на велосипеде, пробежки, гимнастика, прогулки на свежем воздухе, плаванье, теннис) ;
  • ограничьте потребление алкогольных напитков. Без серьезных последствий для организма в сутки допустимо употреблять 20 грамм чистого спирта (это бутылка пива, 2 бокала вина или 50 гр качественной водки);
  • проходите ежегодный медосмотры по достижении 40 лет (УЗИ сердца и сосудов, ЭКГ, биохимический анализ крови, МРТ головного мозга).
  • устраните повышенные психоэмоциональные нагрузки и стрессы. Если полностью ограничить себя от них не удается, защитите нервную систему с помощью успокаивающих препаратов на растительной основе (Фитоседан, Персен, Тенотен, Афобазол, Гербион и т.п.);
  • откажитесь от курения.


Особое внимание профилактике инсульта должны уделять лица из группы риска с:

  • повышенной свертываемостью крови;
  • стажем курения более 5 лет;
  • диабетом;
  • наследственностью.

Инсульт у женщин может наблюдаться уже в возрасте 25-30 лет. Заболевание у женской половины протекает с осложнениями, а восстановление происходит медленнее, чем у мужчин. К факторам риска у женщин добавляются период беременности и прием оральных контрацептивов.
Еще одна особенность, которая может спровоцировать инсульт у женщин — климакс. После репродуктивного возраста работа организма перестраивается, снижается скорость обмена веществ, начинают беспокоить проблемы с сердцем и сосудами. Чтобы избежать инсульта, женщинам после климакса, а еще лучше не дожидаясь его, нужно поменять свой образ жизни и привычки:

  • скорректируйте питание — уменьшите количество жирной, копченой и жареной пищи, добавьте овощи и фрукты, богатые витамином С (цитрусовые, зелень, все виды капусты);
  • следите, чтобы вес был пропорционален вашему росту;
  • сократите потребление алкогольных напитков до минимума, предпочтение отдавайте красному вину, так как в нем содержится резерватрол, который благоприятно влияет на работу сердца и мозга;
  • откажитесь от курения, так как сигаретный дым сгущает кровь, угарный газ от сигарет мешает поступлению крови к мозгу, а никотин повышает давление;
  • следите за режимом сна — максимальная продолжительность сна для людей из группы риска составляет 7 часов;
  • замените гормональные виды контрацепции на другие, поскольку данный тип повышает риск образования тромбов (особенно у женщин старше 35 лет).

Кроме того, интеллектуальная деятельность улучшает работу мозга. Решение кроссвордов и ребусов, изучение иностранных языков и чего-либо нового тонизируют сосуды головного мозга и улучшает проводимость нейронов.

Для профилактики инсульта во время беременности соблюдайте следующие рекомендации:

  • при превышении набора веса, придерживайтесь диеты;
  • контролируйте артериальное давление;
  • принимайте витамины ля укрепления сосудов;
  • пейте больше воды, чтобы улучшить процесс пищеварения;
  • выполняйте упражнения для поднятия тонуса мышц и улучшения кровообращения;
  • гуляйте на свежем воздухе для улучшения циркуляции лимфы.

Хронические стрессы, перекусы «на ходу», неблагоприятная экологическая обстановка приводят к снижению работы сосудов, что снижает кровоснабжения головного мозга. При наличии одного из провоцирующего фактора, специалистом составляется индивидуальная программа профилактики геморрагического инсульта.

Длительное и устойчивое повышение артериального давления – основная причина развития острого нарушения кровообращения в головном мозге. Поэтому пациентам, относящимся к группе риска, рекомендуется вести контроль показателей давления, не реже одного раза в неделю. А гипертоникам следует ежедневно записывать значения, измеряя давление в одно и то же время.

При повышении значений свыше 140/90 мм рт. ст., рекомендуется обратиться к доктору для назначения медикаментов, способных понизить эти показатели. Регулярное употребление антигипертензивных средств и соблюдение указаний специалиста является первичной профилактикой инсульта.

Лучшая профилактика инсульта – это соблюдение рациональности в питании и исключение вредных продуктов. DASH-диета (рекомендованная при гипертонии) подразумевает сокращение количества употребляемой соли и животных жиров. Разрешенная норма соли в сутки – 5 гр., а животных жиров – 25–30 гр. Из рациона следует исключить:

  • продукты горячего и холодного копчения;
  • покупную колбасную продукцию;
  • консервацию с содержанием уксуса и лимонной кислоты.

А также ограничить употребление сливочного масла, мяса (жаренного и жирных сортов), яиц. При наличии лишнего веса, снизить количество употребляемых калорий и выполнять несложные физические упражнения.

Малоподвижный образ жизни провоцирует развитие заболеваний скелетно-мышечной и сердечно-сосудистой системы. Поэтому средством профилактики инсульта считается умеренная и регулярная физическая активность. Рекомендуемая продолжительность тренировки – 30 минут, 4–5 раз в неделю.

Занятия аэробикой подойдут в качестве профилактики инсульта у женщин и мужчин. При выполнении аэробных упражнений организм насыщается кислородом улучшается метаболизм в тканях.

Пациентам с гипертонией или остеохондрозом рекомендуется избегать силовых тренировок. В этом случае подойдут упражнения, повышающие выносливость организма:

  • спортивная ходьба;
  • пробежка трусцой (6–9 км в час);
  • аквааэробика и плавание;
  • катание на лыжах;
  • езда на велосипеде.

Вторичная профилактика инсульта состоит из комплексной медикаментозной терапии:

  • лекарства для улучшения текучести крови (Варфарин, Кардиомагнил, Тромбо АСС, Курантил, Плавикс) — постоянно;
  • препараты, которые активизируют обмен веществ головного мозга (Церебролизин, Кортексин, Цераксон, Фезам);
  • медикаменты для стимуляции кровообращения (Трентал, Винпоцетин, Актовегин, Церебролизин).


Для пациентов, перенесших операцию, после гемморрагического инсульта в профилактических целях назначают:

  • средства, корректирующие давление при гипертонии (Эналаприл, Метопролол, Фуросемид, Липразид);
  • успокоительные (Корвалол, настойка валерианы, Персен, Гидозепам,);
  • препараты для укрепления сосудов (Аскорутин, Профилактин С, Билобил, Гинкор Форт).

Кроме того, к методам вторичной профилактики добавляют:

  • реабилитацию с постепенным повышением физических нагрузок (ЛФК, массаж, прогулки);
  • полный отказ от вредных привычек;
  • строгую диету с ограничением продуктов, содержащих холестерин;
  • медикаментозную терапию, назначенную лечащим врачом;
  • регулярные медосмотры.

Медикаментозная профилактика инсульта головного мозга у женщин и мужчин включает регулярный прием лекарственных средств, нормализующих артериальное давление, улучшающих кровообращение в организме и повышающих прочность сосудистых стенок.

Это группа препаратов, которые улучшают деятельность центральной системы, повышают устойчивость сосудов головного мозга к различным агрессивным воздействиям. Регулярный прием обеспечивает устойчивость нейронов в неблагоприятных условиях и улучшает проводимость нервной системы. Ноотропные лекарства, используемые для профилактики инсульта головного мозга:

  • Аминалон (гамма-аминомасляная кислота);
  • Пантонам (гопантеновая кислота);
  • Глицин (алифатическая аминокислота);
  • Ноотропил (Пирацетам);
  • Фенотропил (Фонтурацетам);
  • Пиритинол (Энцефабол);
  • Глиатилин (холина альфосцерат);
  • Гинкго Билоба (экстракт листьев).

Лечение и профилактику инсульта ноотропными препаратами проводят в течение месяца, принимая по 1–2 таблетки в день.

Блокирующие лекарства для профилактики инсульта используют в комплексе с другими препаратами. Эффективными являются:

  • Атенолол (β1-адреноблокатор);
  • Метопролол (кардиоселективный липофильный β1-блокатор).

Для профилактики инсульта рекомендуется в день принимать до двух таблеток, после приема пищи.

Несмотря на короткое действие препаратов, они эффективно нормализуют частоту сердечных сокращений и снижают артериальное давление. Препаратами для профилактики инсульта являются:

  • Нифедипин (производное дигидропиридина);
  • Верапамил.

Использование аспирина для профилактики инсульта заключается в предотвращении образования тромбов, которые провоцирует ОНМК. Рекомендуемые препараты:

  • Кардиомагнил (гидроксид магния и ацетилсалициловая кислота);
  • Аспекард (стеариновая и ацетилсалициловая кислота).

Противоагрегатные таблетки для профилактики инсульта мозга принимают перед сном, запивая стаканом воды.

Эта группа медикаментов успокаивает нервную систему, снимает раздражительность и предупреждает повышение артериального давления. Используются для первичной и вторичной профилактики ишемического инсульта. К представителям этой группы относятся:

  • экстракт Валерианы лекарственной;
  • Персен (комбинированный растительный препарат);
  • Фитосед (на основе боярышника);
  • Ново-пассит (многокомпонентный растительный препарат).

Принимать успокоительные средства рекомендуется 2–3 раза в день для профилактики инсультов.


Травяные настои способствую лечению атеросклеротического поражения сосудов головного мозга. Но Профилактика инсульта народными методами будет успешной, если сочетать ее с сбалансированным питанием и физическими нагрузками.

Для профилактики ишемического инсульта головного мозга рекомендуется ежедневно употреблять травяной чай, содержащий:

Столовую ложку компонентов, взятых в равных пропорциях, залейте двумя стаканами кипятка и настаивайте 1–2 часа. Принимайте по 100–150 мл перед утренним и вечерним приемом пищи. Этот лекарственный напиток выводит из организма лишнюю жидкость, способствует разжижению крови и снимает отечность ног.

Для приготовления средства понадобятся зеленые шишки сосны.

  1. 100 гр. шишек тщательно промойте.
  2. Измельчите и залейте 1 стаканом 70% спирта.
  3. Настивайте смесь 14 дней в темном месте. Каждый день встряхивайте пузырек с содержимым.
  4. Процедите и принимайте по 1 ч. л. один раз в день (утром).

Курс профилактики сосновыми шишками длится месяц, после нужно сделать перерыв на 8 недель.

  • Настой на корне валерианы. Компонент мелко нарезать и залить кипятком (200 мл). Смесь прокипятить 10–12 минут и остудить при комнатной температуре. Процедить через марлю, сложенную в несколько слоев. Для профилактики инсульта головного мозга у мужчин и женщин, настой принимать по 100–120 мл после утреннего приема пищи.
  • Настойка на основе мелиссы. Необходимо взять две десертных ложки травы и залить кипящей водой. Оставить настаиваться на 3–4 часа. Это народное средство для профилактики инсульта головного мозга принимать два раза в день по столовой ложке.
  • Настойка на основе чеснока. Зубчики молодого чеснока (2–3 шт.) измельчить и засыпать сахаром (3 ст. л.). Когда смесь пустит сок, подлить кипятка (150 мл) и перемешать. Оставить настаиваться в темном и прохладном месте, на шесть часов. Настой перелить в стеклянную посуду, использую марлю. Принимать лекарственный препарат для профилактики инсульта головного мозга у мужчин и женщин до еды, выпивая десертную ложку.
  • Свежевыжатый сок из свеклы с медом. Главным свойством сока из этого овоща является способность растворять холестериновые образования, прикрепленные к стенкам кровеносных сосудов. Для профилактики инсульта головного мозга сок (100 мл) смешивается с чайной ложкой меда, перемешивается до полного растворения и употребляется до приема пищи.
  • Масло из косточек облепихи. Прием одной чайной ложки этого средства помогает нормализовать уровень холестерина в организме.
  • Настой из лекарственных трав. Смешивается по 1 ст. л. зверобоя, листьев мяты и плодов дикой розы. Смесь заливается кипятком и настаивается в течение получаса. Полученный травяной напиток употребляется с медом, вместо сахара, три раза в день.

Пациентам, перенесшим острое нарушение кровообращения в головном мозге, следует с повышенным вниманием относиться к профилактике и симптомам инсульта. Соблюдение указаний врача и ответственный подход к здоровью, помогает снизить вероятность повторного развития патологического процесса.

Профилактика повторного инсульта головного мозга у женщин и мужчин заключается в постоянном контроле артериального давления и обращении за помощью даже при незначительном ухудшении самочувствия.

Реабилитационный период включает посещение консультаций психотерапевта, мануального специалиста и занятия ЛФК. К профилактике осложнений инсульта добавляют регулярный прием церебропротекторов и антикоагулянтов.

Источник статьи: http://booklab.ru/aktivnost-substanczii-insulina-opredelyayut-na-krolikah/

bezinsulina