Ген который кодирует синтез инсулина

Метод рекомбинантных днк для инсулина

Метод рекомбинантных днк для инсулина

• Инсулин — пептидный гормон, выделяемый β-клетками о. Лангенгарса.

• Состоит из двух пептидных цепей: А-цепь — из 21 аминокислотных остатков. В-цепь содержит 30 аминокислотных остатков

• Эти две цепи связаны бисульфидными –S-S- связями, которые обеспечивают пространственную структуру белка инсулина.

• При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина — проинсулин.

• Проинсулин состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных остатков.

• С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и проинсулин переходит в активный инсулин.

• До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота

Инсулин был первым лекарственным рекомбинантным препаратом, полученным в промышленных масштабах еще в 1982 г. Как известно, инсулин широко применяется при лечении инсулино-зависимой формы сахарного диабета.

Молекула инсулина состоит из двух цепей А-цепь – 21 аминокислота и В- цепь – 30 аминокислот. Молекула стабилизирована тремя дисульфидными связями, которые необходимы для ее нормального функционирования.

В организме человека и животных синтезируется проинсулин, в котором А и В-цепи соединены С-пептидом. После синтеза С-пептид выщепляется под действием протеолитических ферментов с образованием инсулина.

До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота. Однако такой способ получения инсулина имел целый ряд недостатков:

1)недостаток поголовья скота;

2)сложности хранения и транспортировки сырья;

3)трудности выделения и очистки гормона;

4)возможность развития аллергических реакций.

Все это сделало необходимым поиск альтернативных источников получения препарата. До настоящего времени единственным вариантом такого получения является микробиологический синтез с использованием рекомбинантных микроорганизмов.

В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами:

1) модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом;

Метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr.

Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека.

2) генно-инженерным способом;

[attention type=red]
Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека. В первом случае (2.
[/attention]

1) осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ. Во втором (2.

2) — получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона.

Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и ренатурации).

Метод 2.1. Раздельный синтез А- и В-цепей с последующим заключением между ними дисульфидных связей.

• 1. Путем химического синтеза создаются последовательности нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей (создание синтетических генов).

• 2. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В).

• 3. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться активной репликации плазмид.

• 4. Плазмиды вводят в клетку E. coli- кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь.

• 5. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих Аи В цепи.

• 6. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей.

• 7. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин.

Недостатки подобного метода: надо получать два отдельных штамма-продуцента, проводить две ферментации, две процедуры выделения и очистки, а самое главное, трудно обеспечить правильное замыкание дисульфидных связей, то есть получить активный инсулин.

Метод 2.2. Синтез проинсулина с последующим выщеплением С-_пептида. При этом конформация проинсулина обеспечивает правильное замыкание дисульфидных связей, что делает второй способ микробиологического синтеза более перспективным.

• В 1975 г. У.Гилберт предложил следующую схему синтеза инсулина:

• Из опухолевых клеток поджел. железы выделяется мРНК инсулина.

• С помощью обратной транскриптазы мРНК получают кДНК.

• Полученную кДНК встраивают в плазмиду рBR322 E. Coli в среднюю часть гена пенициллинидазы.

• Рекомбинантная плазмида содержит информацию о структуре проинсулина.

• В результате трансляции мРНК в клетках синтезируется гибридный белок, содержащий последовательности пенициллинидазы и проинсулина.

• Проинсулин выщепляли из данного белка трипсином.

• Из проинсулина выделяется инсулин.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения:Сдача сессии и защита диплома — страшная бессонница, которая потом кажется страшным сном. 8523 — | 7044 — или читать все.

178.45.150.72 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)

очень нужно

Должна быть возможность сделать клетки микроорганизмов компетентными для того, чтобы их клеточная стенка была бы проницаема для плазмид.

Аминокислот состоит в том, что они перетаскивают белок в липидную мембрану, в которой с помощью определенных ферментов (сигнальных протеаз), гидрофобная последовательность отщепляется и образуется нужный целевой продукт – это рекомбинантный белок, выходящий в среду.

Микроорганизмы должны хорошо и интенсивно размножаться в условиях ферментера.

Микроорганизмы должны быть не патогенны.

Метаболизм микроорганизма должен быть хорошо изучен, поэтому в качестве продуцентов рекомбинантных белков используют именно такие микроорганизмы: это Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisie.

Пептидных факторов роста тканей

Вакцин (против гепатита В0

• рекомбинантных интерферонов (они представляют неспецифическую защиту клетки от вирусов и злокачественных образований)

На первом месте среди них по значению стоит рекомбинантный инсулин, составляющий около 30% от всего рынка рекомбинантной продукции.В проблеме производства рекомбинантных белков очень важно, чтобы используемые в этом случае микроорганизмы, в которые вносят чужеродныегены, удовлетворяли бы следующим свойствам:

4. Желательно, чтобы микроорганизм был способен выделять секретируемый им чужеродный белок в среду. Это можно достичь, если ввести в клетку реципиента ген, который синтезирует рекомбинантный белок с дополнительной аминокислотной последовательностью, состоящий из гидрофобных аминокислот.Роль гидрофобных

Инсулин, как вы знаете, является регулятором углеводного обмена. В организме человека инсулин синтезируется в бетаклетках островков Лангерганса поджелудочной железы. При отсутствии или недостатке его синтеза развивается такое заболевание как сахарный диабет (инсулинозависимый диабет – 1 типа).

При сахарном диабете повышается содержание глюкозы в крови и развиваются патологические процессы. Диабет II типа (инсулинозависимый) возникает при дефектах в структуре рецепторов, отвечающих за проникновение глюкозы в клетку. Все эти сведения касаются этиологии такого заболевания как сахарный диабет.

Следующий вопрос, который надо рассмотреть, это структура инсулина.Итак, инсулин это пептидный гормон, состоящий из двух пептидных цепей:

А-цепь состоит из 21 аминокислотных остатков.

В-цепь состоит из 30 аминокислотных остатков

Эти две цепи связаны бисульфидными SS связями, которые обеспечивают

пространственную структуру белка инсулина.

При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина, так называемый проинсулин. Этот проинсулин состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных остатков.

С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и проинсулин переходит в активный инсулин. Есть разные способы получения инсулина. Мы остановимся на получении инсулина биосинтетическим путем, с точки зрения преимущества этого метода. Итак, преимущества получения инсулина биосинтетическим путем.

До внедрения в промышленность метода получения инсулина с использованием рекомбинантных микроорганизмов существовал только один способ получения инсулина – из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней.

Инсулин, получаемый из поджелудочной железы крупного рогатого скота отличается от инсулина человека на 3 аминокислотных остатка, а инсулин, получаемый из железы свиньи, только на один аминокислотный остаток, то есть он ближе к человеческому инсулину.

Тем не менее, при введении белков, отличающихся по структуре от белков человека даже в таком незначительном выражении, возможно возникновение аллергических реакций. Такой инсулин, как чужеродный белок, также может и инактивироваться в крови образующимися антителами.

Кроме того, для получения 1 килограмма инсулина требуется 35 тысяч голов свиней (если известно, что годовая потребность в инсулине -1 тонна препарата). С другой стороны, биосинтетическим путем можно получить такое же количесвто инсулина, проведя биосинтез в 25 кубовом ферментере, используя рекомбинантный микроорганизм Escherichia coli. Биосинтетический метод получения инсулина стал применяться в начале 80-х годов (восьмидесятых годов).

Остановимся на схеме получения рекомбинантного инсулина (фирма Eli Lilli-Эли-Лилли, Соединенные Штаты Америки):

1. этап Путем химического синтеза были созданы последовательности

нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей, то есть были

созданы синтетические гены.

2. 11 этап. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну

плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят

3. 111 этап. Вводят ген, кодирующий образование фермента

бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того,

чтобы добиться бурной репликации плазмид.

4. 1У этап. Вводят плазмиды в клетку Escherichia coli – кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь.

5. V этап. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют

галактозу, которая индуцирует образование фермента

бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются,

образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих А и В цепи.

6. VI этап. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с

бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют

А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую

очистку и выделение А и В цепей.

7. VII этап. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают

Инсулин, полученный этим путем является человеческим инсулином по своей структуре. Применение современных методов очистки исключает наличие в инсулине эндотоксинов и пирогенных примесей.

Дата добавления: 2013-12-13 ; 1142 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

Поверхностные покрытия
Поверхностные покрытия (краски, различные типы лаков) иг­рают двоякую роль: они выполняют декоративную функцию и защищают покрываемую поверхность от вредных воздействий среды, в том числе и от микроор .

Сжиженные газы хранят в сосудах Дьюара
Сжиженные газы хранят в сосудах Дьюара, которые представляют собой стеклянные или металлические колбы с двойными стенками (рис. 1). Из пространства между стенками откачан воздух, что приводит к уменьш .

Интерферон, Гормон роста, Вакцины
ИнтерферонИнтерфероны — это группа белков, открытых в ходе изучения веществ, вырабатываемых клетками, зараженными вирусами. Они индуцируют как локальные, так и системные противови­русные реакции .

Хлеб и другие продукты
В Англии большинство хлебопродуктов производится по техно­логии Chorleywood Bread Process, но в других странах исполь­зуется много других технологий хлебопечения. Для производст­ва хлеба до сих пор пр .

Извлечение полезных веществ
Одна из главных задач технологии, связанной с окружающей средой, — это сохранение природных ресурсов путем повторно­го использования полезных веществ, содержащихся в отходах. Некоторые разработк .

Биодеградация нефтяных загрязнений
Рассмотрим теперь процессы биодеградации сложных смесей углеводородов и их производных в средах, загрязненных нефтью. Речь пойдет как о сточных водах нефтяной промыш­ленности, так и о загрязнении нефт .

Биотопливные элементы
После того как в конце XIX в. были созданы топливные эле­менты, появилась возможность эффективно осуществлять пре

Получение рекомбинантного инсулина

• Инсулин – пептидный гормон, выделяемый β-клетками о. Лангенгарса.

• Состоит из двух пептидных цепей: А-цепь – из 21 аминокислотных остатков. В-цепь содержит 30 аминокислотных остатков

• Эти две цепи связаны бисульфидными –S-S- связями, которые обеспечивают пространственную структуру белка инсулина.

• При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина – проинсулин.

• Проинсулин состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных остатков.

• С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и проинсулин переходит в активный инсулин.

• До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота

Инсулин был первым лекарственным рекомбинантным препаратом, полученным в промышленных масштабах еще в 1982 г. Как известно, инсулин широко применяется при лечении инсулино-зависимой формы сахарного диабета.

Молекула инсулина состоит из двух цепей А-цепь – 21 аминокислота и В- цепь – 30 аминокислот. Молекула стабилизирована тремя дисульфидными связями, которые необходимы для ее нормального функционирования.

В организме человека и животных синтезируется проинсулин, в котором А и В-цепи соединены С-пептидом. После синтеза С-пептид выщепляется под действием протеолитических ферментов с образованием инсулина.

До получения рекомбинантного инсулина препарат получали из поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота. Однако такой способ получения инсулина имел целый ряд недостатков:

1)недостаток поголовья скота;

2)сложности хранения и транспортировки сырья;

3)трудности выделения и очистки гормона;

4)возможность развития аллергических реакций.

Все это сделало необходимым поиск альтернативных источников получения препарата. До настоящего времени единственным вариантом такого получения является микробиологический синтез с использованием рекомбинантных микроорганизмов.

В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами:

1) модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом;

Метод основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной заменой на С-конце В-цепи Ala30Thr.

Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединение вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепления защитной О-трет-бутильной группы получают инсулин человека.

2) генно-инженерным способом;

[attention type=red]
Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека. В первом случае (2.
[/attention]

1) осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ. Во втором (2.

2) – получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона.

Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и ренатурации).

Метод 2.1. Раздельный синтез А- и В-цепей с последующим заключением между ними дисульфидных связей.

• 1. Путем химического синтеза создаются последовательности нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей (создание синтетических генов).

• 2. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В).

• 3. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться активной репликации плазмид.

• 4. Плазмиды вводят в клетку E. coli- кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь.

• 5. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих Аи В цепи.

• 6. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей.

• 7. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин.

Недостатки подобного метода: надо получать два отдельных штамма-продуцента, проводить две ферментации, две процедуры выделения и очистки, а самое главное, трудно обеспечить правильное замыкание дисульфидных связей, то есть получить активный инсулин.

Метод 2.2. Синтез проинсулина с последующим выщеплением С-_пептида. При этом конформация проинсулина обеспечивает правильное замыкание дисульфидных связей, что делает второй способ микробиологического синтеза более перспективным.

• В 1975 г. У.Гилберт предложил следующую схему синтеза инсулина:

• Из опухолевых клеток поджел. железы выделяется мРНК инсулина.

• С помощью обратной транскриптазы мРНК получают кДНК.

• Полученную кДНК встраивают в плазмиду рBR322 E. Coli в среднюю часть гена пенициллинидазы.

• Рекомбинантная плазмида содержит информацию о структуре проинсулина.

• В результате трансляции мРНК в клетках синтезируется гибридный белок, содержащий последовательности пенициллинидазы и проинсулина.

• Проинсулин выщепляли из данного белка трипсином.

• Из проинсулина выделяется инсулин.

Рекомбинантный инсулин человека впервые синтезированы цепи

РЕКОМБИНАНТНЫЙ ИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА

Впервые синтезированы цепи инсулина человека с помощью E. coli в 80 – годах, которые были затем соединены в молекулу биологически активного гормона. В Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E. coli.

Использование аффинной хроматографии значительно снизило содержание в препарате загрязняющих белков с более высокой м. м. , чем у инсулина. К таким белкам относятся проинсулин и частично расщепленные проинсулины, которые способны индуцировать выработку антиинсулиновых антител.

Использование человеческого инсулина с самого начала терапии сводит к минимуму возникновение аллергических реакций. Человеческий инсулин быстрее абсорбируется и независимо от формы препарата имеет более короткую длительность действия, чем животные инсулины. Человеческие инсулины менее иммуногены, чем свиные, особенно смешанные бычьи и свиные инсулины.

Препараты инсулина человека по химической структуре полностью идентичны человеческому инсулину. Основной проблемой биосинтетического метода получения инсулина человека является полная очистка конечного продукта от малейших примесей использованных микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности.

Новые методы контроля качества гарантируют, что биосинтетические инсулины человека свободны от какихлибо вредных примесей; таким образом, их степень очистки и сахароснижающая эффективность отвечают самым высоким требованиям и являются практически одинаковыми.

Каких-либо нежелательных побочных действий, зависящих от примесей, препараты инсулина не имеют.

В настоящее время в медицинской практике используют инсулины трех типов: короткодействующие с быстрым началом эффекта; средней продолжительности действия; длительного действия с медленным проявлением эффекта.

Инсулин человека можно производить четырьмя способами: 1) ПОЛНЫМ ХИМИЧЕСКИМ СИНТЕЗОМ; 2) ЭКСТРАКЦИЕЙ ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ ЧЕЛОВЕКА (оба этих способа неэкономичны: недостаточная разработанность первого способа и недостаток сырья для массового производства вторым способом); 3) ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКИМ МЕТОДОМ с помощью ферментно-химической замены в положении 30 Вцепи аланина в свином инсулине на треонин; 4) БИОСИНТЕТИЧЕСКИМ СПОСОБОМ по генноинженерной технологии. Два последних метода позволяют получить человеческий инсулин высокой степени очистки.

В настоящее время инсулин человека, в основном, получают двумя способами: модификацией свиного инсулина синтетикоферментативным методом и генно-инженерным способом.

Инсулин оказался первым белком, полученным для коммерческих целей с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека.

В первом случае осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ.

Во втором – получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона.

Наиболее предпочтительным в настоящее время является получение инсулина в виде предшественника, обеспечивающее правильность замыкания дисульфидных мостиков (в случае раздельного получения цепей проводят последовательные циклы денатурации, разделения изоформ и ренатурации).

При обоих подходах возможно как индивидуальное получение исходных компонентов (А- и В-цепи или проинсулин), так и в составе гибридных белков.

Помимо А- и В-цепи или проинсулина, в составе гибридных белков могут присутствовать: – белок носитель, обеспечивающий транспортировку гибридного белка в периплазматическое пространство клетки или культуральную среду; – аффинный компонент, существенно облегчающий выделение гибридного белка.

При этом оба эти компонента могут одновременно присутствовать в составе гибридного белка. Кроме этого, при создании гибридных белков может использоваться принцип мультимерности, (то есть, в гибридном белке присутствует несколько копий целевого полипептида), позволяющий существенно повысить выход целевого продукта.

В Великобритании с помощью E. coli синтезированы обе цепи человеческого инсулина, которые затем были соединены в молекулу биологически активного гормона. Чтобы одноклеточный организм мог синтезировать на своих рибосомах молекулы инсулина, необходимо снабдить его нужной программой, то есть ввести ему ген гормона.

Химическим способом получают ген, программирующий биосинтез предшественника инсулина или два гена, программирующие в отдельности биосинтез цепей А и В инсулина. Следующий этап – включение гена предшественника инсулина (или гены цепей порознь) в геном E. coli – особого штамма кишечной палочки, выращенного в лабораторных условиях. Эту задачу выполняет генная инженерия. Из E.

coli вычленяют плазмиду соответствующей рестриктазой. синтетический ген встраивается в плазмиду (клонированием с функционально активной С-концевой частью β-галактозидазы E. coli). В результате E. coli приобретает способность синтезировать белковую цепь, состоящую из галактозидазы и инсулина. Синтезированные полипептиды отщепляют от фермента химическим путем, затем проводят и очистку.

В бактериях синезируется около 100000 молекул инсулина на бактериальную клетку.

Природа гормонального вещества, продуцируемого E. coli, обусловлена тем, какой ген встраивается в геном одноклеточного организма.

Если клонирован ген предшественника инсулина, бактерия синтезирует предшественник инсулина, который подвергается затем обработке рестриктазами для отщепления препептида с вычленением С-пептида, вследствие чего получается биологически активный инсулин.

Для получения очищенного инсулина человека выделенный из биомассы гибридный белок подвергают химко-ферментативной трансформации и соответствующей хроматографической очистке (фронтальной, гельпроникающей, анионообменной).

Можно использовать штамм со встроенной в плазмиду нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и присоединенного к его N-концу через остаток метионина фрагмента белка А Staphylococcus aureus.

Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого in tube приводят к инсулину.

Возможен и другой путь: получается в бактериальной системе экспрессии слитой рекомбинантный белок, состоящий из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового “хвоста”. Его выделяют, используя хелатную хроматографию на колонках с Ni-агарозой из телец включения и расщепляли бромцианом.

Выделенный белок является S-сульфонированным. Картирование и массспектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на анионите и ОФ (обращеннофазовой) ВЭЖХ, показывают наличие дисульфидных мостиков, соответствующих дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека.

В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так, например, можно получить слитой белок, состоящий из лидерного пептида интерлейкина 2 присоединенного к N-концу проинсулина, через остаток лизина. Белок эффективно экспрессируется и локализуется в тельцах включения.

После выделения белок расщепляется трипсином с получением инсулина и С-пептида. Полученные инсулин и С-пептид очищались ОФ ВЭЖХ. При создании слитых конструкций весьма существенным является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида.

С-пептиды соединяются по принципу “голова-хвост” с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином. ВЭЖХ продуктов расщепления показывает, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.

Рекомбинантная ДНК: описание, характеристики

Рекомбинантная ДНК – это молекулы, образованные лабораторными методами генетической рекомбинации для объединения генетического материала из множества источников. Она возможна потому, что молекулы ДНК всех организмов имеют одинаковую химическую структуру и отличаются только нуклеотидной последовательностью в ее пределах.

Создание

Молекулярное клонирование – это лабораторный процесс, используемый для создания рекомбинантной ДНК. Это один из двух наиболее широко используемых методов, наряду с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Он позволяет управлять репликацией любой конкретной последовательности ДНК, выбранной экспериментатором.

Есть два фундаментальных различия между методами рекомбинантных ДНК. Одним из них является то, что молекулярное клонирование включает репликацию в живой клетке, а ПЦР – в пробирке. Другое отличие состоит в том, что первый метод допускает вырезание и вставку последовательностей ДНК, а второй усиливается путем копирования существующей очередности.

Вектор ДНК

Получение рекомбинантной ДНК требует клонирующего вектора. Он происходит от плазмид или вирусов и представляет собой относительно небольшой сегмент.

Выбор вектора для молекулярного клонирования зависит от выбора организма-хозяина, размера клонируемой ДНК и от того, должны ли экспрессироваться чужеродные молекулы.

Сегменты могут быть объединены с использованием различных методов, таких как клонирование рестриктазы / лигазы или Сборки Гибсона.

Клонирование

В стандартных протоколах клонирование включает семь этапов.

  1. Выбор организма-хозяина и вектора клонирования.
  2. Получение ДНК-вектора.
  3. Формирование клонируемой ДНК.
  4. Создание рекомбинантной ДНК.
  5. Введение ее в организм хозяина.
  6. Отбор организмов, ее содержащих.
  7. Выбор клонов с желаемыми вставками ДНК и биологическими свойствами.

После трансплантации в организм хозяина чужеродные молекулы, содержащиеся в рекомбинантной конструкции, могут экспрессироваться или неэкспрессироваться. Экспрессия требует реструктуризации гена для включения последовательностей, которые необходимы для продуцирования ДНК. Она используется трансляционным аппаратом хозяина.

Как работает

Рекомбинантная ДНК работает, когда клетка-хозяин экспрессирует белок из рекомбинантных генов. Экспрессия зависит от окружения гена набором сигналов, которые обеспечивают инструкции для его транскрипции. Они включают в себя промотор, связывание рибосомы и терминатор.

Проблемы возникают, если ген содержит интроны или сигналы, которые действуют как терминаторы для бактериального хозяина. Это приводит к преждевременному прекращению.

Рекомбинантный белок может быть неправильно обработан, свернут или подвергнут разложению. Его производство в эукариотических системах обычно происходит в дрожжах и нитчатых грибах.

Использование животных клеток затруднено из-за того, что многим нужна прочная опорная поверхность.

Организмы, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК, имеют явно нормальные фенотипы. Их внешний вид, поведение и метаболизм обычно не изменяются. Единственный способ продемонстрировать наличие рекомбинантных последовательностей – это исследовать саму ДНК с использованием теста полимеразной цепной реакции.

В некоторых случаях рекомбинантная ДНК может оказывать вредное воздействие. Это может случиться, когда ее фрагмент, содержащий активный промотор, располагается рядом с ранее молчащим геном клетки-хозяина.

Использование

Технология рекомбинантной ДНК широко используется в биотехнологии, медицине и исследованиях. Ее белки и другие продукты можно найти практически в каждой западной аптеке, ветклинике, кабинете врача, медицинской или биологической лаборатории.

Наиболее распространенным применением является фундаментальное исследование, в котором технология важна для большинства современных работ в биологических и биомедицинских науках.

Рекомбинантная ДНК используется для идентификации, картирования и последовательности генов, а также для определения их функции. Зонды рДНК используются для анализа экспрессии генов в отдельных клетках и в тканях целых организмов.

Рекомбинантные белки используются в качестве реагентов в лабораторных экспериментах. Некоторые конкретные примеры приведены ниже.

Рекомбинантный химозин

Найденный в сычуге, химозин представляет собой фермент, необходимый для производства сыра. Это была первая генетически модифицированная пищевая добавка, используемая в промышленности. Микробиологически продуцированный рекомбинантный фермент, структурно идентичный ферменту, полученному от теленка, стоит дешевле и производится в больших количествах.

Рекомбинантный человеческий инсулин

Практически полностью заменил инсулин, полученный из животных источников (например, свиней и крупного рогатого скота) для лечения инсулинозависимого диабета. Рекомбинантный инсулин синтезируется путем введения гена человеческого инсулина в бактерии рода этерихий или дрожжи.

Гормон роста

Назначается пациентам, у которых гипофиз генерирует недостаточное количество гормона роста для поддержания нормального развития. До того, как стал доступен рекомбинантный гормон роста, его получали из гипофиза трупов. Эта небезопасная практика привела к тому, что у некоторых пациентов развилась болезнь Крейтцфельда-Якоба.

Рекомбинантный фактор свертывания крови

Это свертывающий кровь белок, который вводят пациентам с формами гемофилии с нарушением свертываемости крови. Они не способны продуцировать фактор VIII в достаточных количествах. До разработки рекомбинантного фактора VIII белок получался путем обработки большого количества крови человека от нескольких доноров. Это несло очень высокий риск передачи инфекционных заболеваний.

Диагностика заражения ВИЧ

Каждый из трех широко используемых методов диагностики ВИЧ-инфекции был разработан с использованием рекомбинантной ДНК. Тест на антитела использует ее белок. Он определяет наличие генетического материала ВИЧ с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Разработка теста стала возможной благодаря молекулярному клонированию и анализу последовательности геномов ВИЧ.

Инсулин человеческий генно-инженерный: наука на службе у человечества

До применения инсулина продолжительность жизни больного сахарным диабетом составляла не более 10 лет. Изобретение этого препарата спасло миллионы пациентов. Человеческий генно-инженерный инсулин – последнее достижение науки.

Результат многолетней напряженной работы

История

До изобретения генно-инженерного (рекомбинантного) препарата инсулин выделяли из поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней.

Отличие свиного инсулина от человеческого – только одна аминокислота

Недостатки этого способа получения препарата:

  • сложность хранения и транспортировки биологического сырья;
  • недостаток поголовья скота;
  • трудности, связанные с выделением и очисткой гормона поджелудочной железы;
  • высокий риск развития аллергических реакций.

С синтезирования в биореакторе натурального человеческого инсулина в 1982 году началась новая биотехнологическая эпоха. Если на заре инсулинотерапии целью ученых было только выживание пациента, в наше время разработка новых препаратов направлена на достижение стойкой компенсации заболевания. Основная цель научных разработок – улучшить качество жизни больного сахарным диабетом.

Современные технологии

Виды препарата в зависимости от способа получения:

Генно-инженерный рекомбинантный

Для производства используется генетически измененная кишечная палочка.

  • отсутствие аллергических реакций;
  • экономичность производства;
  • высокая степень очистки.

Любимица генетиков – кишечная палочка

Генно-инженерный модифицированныйИсходный материал – инсулин свиньи. Производится его модификация генно-инженерным способом.

СинтетическийИскусственно синтезированный препарат, по своему составу полностью идентичен человеческому инсулину.

Что происходит в организме после введения препарата?

Соединяясь с рецептором клеточной мембраны, инсулин образует комплекс, который осуществляет следующие процессы:

  • Улучшает внутриклеточную транспортировку глюкозы и облегчает ее усваивание.
  • Способствует выделению ферментов, которые участвуют в переработке глюкозы.
  • Снижает скорость образования в печени гликогена.
  • Стимулирует жировой и белковый обмен.

В случае подкожного введения инсулин начинает действовать через 20-25 минут. Время действия препарата от 5 до 8 часов. В дальнейшем расщепляется ферментом инсулиназой и выводится с мочой. Препарат не проникает через плаценту и не попадает в грудное молоко.

Когда назначают генно-инженерный инсулин?

Если необходима срочная помощь

Генно-инженерный человеческий инсулин применяется в следующих случаях:

  • Сахарный диабет 1 или 2 типа. Используется в качестве самостоятельного лечения или в комплексе с другими препаратами.
  • При резистентности к пероральным сахароснижающим средствам.
  • При диабете у беременных женщин.
  • В случае осложнений со стороны почек и печени.
  • При переходе на инсулин пролонгированного действия.
  • В предоперационном периоде.
  • В случае развития угрожающих жизни состояний (гиперосмолярной или кетоацидотической комы).
  • В экстренных ситуациях (перед родами, при травмах).
  • Если имеются дистрофические поражения кожи (язвы, фурункулез).
  • Лечение сахарного диабета на фоне инфекции.

Человеческий генно-инженерный инсулин хорошо переносится и не вызывает аллергических реакций, так как полностью идентичен природному гормону.

Важен постоянный контроль!

Запрещено назначение лекарства в случае:

  • снижения уровня сахара в крови;
  • повышенной чувствительности на препарат.

В первые дни после назначения препарата необходимо внимательное наблюдение за пациентом.

Побочные эффекты

Крапивница Опасность! Отек Квинке!

В редких случаях при применении инсулина возможны следующие осложнения:

  • аллергические реакции (крапивница, отек Квинке, зуд кожи);
  • резкое снижение уровня сахара в крови (развивается из-за отторжения препарата организмом или в случае иммунологического конфликта);
  • нарушения сознания;
  • в тяжелых случаях возможно развитие гипогликемической комы;
  • жажда, сухость во рту, вялость, снижение аппетита;
  • гипергликемия (при применении препарата на фоне инфекции или лихорадки);
  • покраснение лица;
  • местные реакции в области введения (жжение, зуд, атрофия или разрастание подкожной жировой клетчатки).

Иногда адаптацию к препарату сопровождают такие нарушения, как отеки и нарушения зрения. Эти проявления, как правило, исчезают через несколько недель.

Как найти в аптеке генно-инженерный инсулин?

Лекарство выпускается в виде раствора для парентерального введения:

Средняя продолжительность действия

Инсулин короткого действия

Двухфазный препарат (комбинация инсулинов короткой и средней продолжительности действия)

Для введения лекарства используется шприц-ручка

Подобрать препарат инсулина с учетом индивидуальных особенностей пациента не составит труда.

Важно! Назначать инсулин может только врач! Он же рассчитывает дозу и контролирует состояние пациента во время курса лечения. Самолечение может привести к трагическим последствиям.

Правила использования

Чаще всего применяется подкожное введение инсулина.

В неотложных случаях лекарство вводится внутривенно.

При тяжелом состоянии пациента

Даже диабетик со стажем может допустить ошибку при применении препарата.

Для того, чтобы избежать осложнений, необходимо:

  • Перед использованием проверить срок годности лекарства.
  • Соблюдать рекомендации по хранению: запасные флаконы должны храниться в холодильнике. Начатый флакон можно хранить при комнатной температуре в темном месте.
  • Убедитесь, что хорошо запомнили нужную дозировку: еще раз прочитайте рецепт врача.
  • Перед инъекцией обязательно выпустить воздух из шприца.
  • Кожа должна быть чистой, но использовать спирт для обработки нежелательно, так как он снижает эффективность препарата.
  • Выбрать оптимальное место для инъекции. При введении под кожу живота препарат подействует быстрее. Медленнее всасывается инсулин при введении в ягодичную складку или плечо.
  • Использовать всю площадь поверхности (профилактика развития местных осложнений). Расстояние между инъекциями должно быть не меньше 2 см.
  • Захватить кожу в складку, чтобы снизить риск попадания в мышцу.
  • Шприц вводить под кожу под углом, чтобы лекарство не вытекло.
  • При инъекциях в живот инсулин короткого действия вводить за 20 минут до приема пищи. В случае выбора плеча или ягодицы – за тридцать минут до еды.

Сочетание с другими лекарственными средствами

Зачастую при сахарном диабете больной принимает несколько медицинских препаратов. Сочетание с другими лекарственными средствами может оказать влияние на лечебное действие генно-инженерного инсулина.

Для профилактики осложнений необходимо знать:

Увеличивают эффект генно-инженерного инсулина, понижая сахар в крови

  • Сульфаниламиды.
  • Ингибиторы МАО (фуразолидон).
  • Ингибиторы АТФ (каптоприл).
  • Нестероидные противовоспалительные (диклофенак, аспирин).
  • Андрогены.
  • Противомалярийные препараты (хинидин).
  • Анаболические стероиды.
  • Антибиотики тетрациклинового ряда (доксициклин).
  • Теофиллин.
  • Морфин.

Уменьшают действие инсулина

  • Глюкокортикоиды (преднизолон, гидрокортизон).
  • Эстрогенсодержащие пероральные контрацептивы.
  • Мочегонные.
  • Амфетамины.
  • Гормоны щитовидной железы.
  • Симпатомиметики (адреналин, мезатон, дофамин).
  • Глюкагон.

Обратите внимание! Мочегонное

Передозировка

В некоторых случаях введение инсулина приводит к внезапному снижению уровня сахара в крови. Проблема часто возникает из-за неправильного подбора дозы препарата.

Начальные симптомы гипогликемии:

  • слабость;
  • бледность кожи;
  • состояние тревоги;
  • головокружение;
  • дезориентация;
  • онемение рук, ног, языка и губ;
  • дрожь конечностей;
  • холодный пот;
  • сильное чувство голода;
  • головные боли.

Тремор Внезапное ухудшение самочувствия

Если вы заметили у себя подобные симптомы, нужно быстро съесть что-нибудь, содержащее легкоусвояемые углеводы. Это может быть печенье, конфета, кусочек сахару или белого хлеба. Хорошо помогает в таких ситуациях сладкий чай.

При ухудшении состояния необходимо вызвать скорую помощь. Гипогликемия может закончиться комой или смертью пациента.

Врачебная помощь: струйное вливание в вену 40% раствора глюкозы, введение глюкагона.

Применение генно-инженерного инсулина при беременности

Добрый день! Меня зовут Снежана. С детства страдаю сахарным диабетом. В последнее время использую «Актрапид». Несколько дней назад узнала о своей беременности.

Я боюсь, что генно-инженерный препарат может повлиять на развитие ребенка, вызвать какие-нибудь мутации. Скажите пожалуйста, может мне заменить лекарство?

Человеческий генно-инженерный инсулин не проникает через плаценту и совершенно безопасен при беременности. Вам нужно обратиться к эндокринологу для того, чтобы скорректировать дозу.

Опасен ли рекомбинантный инсулин?

Добрый день! Врач назначил колоть «Хумалог Микс 25». Но на упаковке написано, что он рекомбинантный! Это что же, я буду вводить себе ГМО? Прочитал в интернете, что эти продукты вызывают рак.

Здравствуйте! Рекомбинантный инсулин ничем не отличается от природного. Для получения его используются генно-модифицированные бактерии.

С помощью технологий генной инженерии производится вживление рекомбинантной ДНК, содержащей ген инсулина, в клетку кишечной палочки. Генно-модифицированные организмы размножаются и вырабатывают гормон. Препарат очень эффективен и отличается высокой степенью очистки.

Источник статьи: http://doktoznaet.ru/metod-rekombinantnyx-dnk-dlya-insulina.html

Гормон инсулин — действие, эффекты, синтез, секреция

Источник:
Клиническая фармакология по Гудману и Гилману, том 4.
Редактор: профессор А.Г. Гилман Изд.: Практика, 2006 год.

Содержание

Введение [ править | править код ]

Эта статья посвящена фармакологическому действию инсулина, глюкагона, соматостатина и пероральных сахаропонижающих средств. Открытие инсулина в 1921 г. произвело переворот в медицине, дав средство для лечения инсулинозависимого сахарного диабета (сахарного диабета типа I) — болезни, которая считалась неизлечимой. В первой части главы описаны физиологические эффекты инсулина и механизмы его действия; тем самым обоснована роль этого гормона в лечении сахарного диабета. В следующей части дана фармакодинамика и фармакокинетика препаратов инсулина, рассмотрены преимущества интенсивной инсулинотерапии и ее роль в предупреждении хронических осложнений сахарного диабета. Далее описаны фармакологические свойства пероральных сахаропонижающих средств, без которых немыслимо лечение инсулинонезависимого сахарного диабета (сахарного диабета типа II) — самой распространенной формы заболевания. В конце главы рассказывается о физиологии и фармакологии глюкагона и соматостатина. Особое внимание уделено все более широкому применению аналогов соматостатина в клинической практике.

Инсулин [ править | править код ]

Историческая справка [ править | править код ]

Открытие инсулина — одно из самых ярких в медицине. Честь открытия принадлежит Бантингу и Бесту, но без предшествующих трудов многих исследователей оно было бы немыслимым. В 1869 г. немецкий студент-медик Пауль Лангерганс обратил внимание, что поджелудочная железа состоит из двух групп клеток — ацинозных, секретируюших пищеварительные ферменты, и иных, собранных в так называемые островки. Лангерганс предположил, что островковые клетки выполняют какую-то особую функцию. О том, какова эта функция, догадались только в 1889 г., когда Оскар Минковски и Йозеф фон Меринг описали у подвергнутых панкреатэктомии собак синдром, похожий на сахарный диабет (Minkowski, 1989).

Затем последовало множество попыток выделить из поджелудочной железы вещество, регулирующее уровень глюкозы в крови. В начале 1900-х гг. немецкий терапевт Георг Людвиг Цюльцер решился ввести вытяжку из поджелудочной железы умирающему от сахарного диабета больному. Больному стало лучше, но ненадолго: когда запасы вытяжки закончились, он впал в кому и скончался. Еще одна попытка найти антидиабетический фактор была предпринята в 1911 г. Э. Л. Скоттом, студентом Чикагского университета. Он лечил собак с экспериментальным сахарным диабетом с помощью спиртового экстракта поджелудочной железы (кстати, почти такого же, какой впоследствии использовали Бантинг и Бест). Однако научный руководитель Скотта счел эти эксперименты неубедительными, поскольку тот не проводил измерений уровня глюкозы в крови. С 1916 по 1920 г. румынский физиолог Николае Паулеску поставил серию опытов, в которых показал, что введение вытяжки из поджелудочной железы собакам с экспериментальным сахарным диабетом снижает содержание глюкозы и кетоновых тел в моче. Несмотря на то что эти результаты были опубликованы, работу Паулеску оценили по достоинству только много лет спустя.

Не подозревая о работах своих предшественников, молодой канадский хирург из Торонто Фредерик Г. Бантингв 1921г.упросил профессора физиологии Джона Дж. Р. Маклеода пустить его в лабораторию для выделения антидиабетического фактора из поджелудочной железы. Бантинг предположил, что секретируемый островковыми клетками гормон (инсулин) быстро разрушается протеазами — во время экстракции или еще до нее. Вместе с Чарльзом Г. Бестом, студентом-медиком четвертого курса, он стал перевязывать протоки поджелудочной железы чтобы избежать протеолиза. После перевязки ацинозные клетки подвергались дегенерации, а островки оставались интактны-ми, и из них с помощью этанола и кислоты был экстрагирован антидиабетический фактор. Полученный экстракт снижал уровень глюкозы в крови у собак с экспериментальным сахарным диабетом.

Первым больным, получившим экстракт Бантинга и Беста, был четырнадцатилетний Леонард Томпсон (Banting et al., 1922), госпитализированный в Торонтскую городскую больницу с уровнем глюкозы в крови 500 мг% (28 ммоль/л) и суточным диурезом 3—5 л. Несмотря на строгую диету (450 ккал/сут), глюкозурия нарастала, и без инсулина мальчик бы погиб через несколько месяцев. Пробное введение экстракта поджелудочной железы привело к снижению уровней глюкозы в крови и моче. Тогда исследователи стали вводить мальчику зкстракг ежедневно, вслед за чем последовало немедленное улучшение. Суточная экскреция глюкозы снизилась со 100 до 7,5 г. Кроме того, «мальчик повеселел, окреп и сказал, что чувствует себя значительно лучше». Таким образом, заместительная терапия новым гормоном — инсулином — позволила предотвратить неизбежную смерть от сахарного диабета (Banting et al., 1922). В последующий год Бантинга и Беста преследовали неудачи. Им никак не удавалось добиться воспроизводимости результатов, то есть раз от раза получать акти вн ые экстракты поджелудочной железы. К решению этой проблемы подключился Маклеод, и, кроме того, Бантинг обратился за помощью к Джеймсу Б. Кол-липу — химику, прославившемуся выделением и очисткой адреналина. Вскоре методика экстрагирования была отлажена, и больные в Северной Америке получили возможность лечиться инсулином, выделенным из поджелудочных желез свиней и крупного рогатого скота. В настоящее время сахарный диабет лечат человеческим инсулином, получаемым методами генной инженерии.

В 1923 г., с удивительной быстротой, Бантинг и Маклеод были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине, и сразу же вокруг нее закипели страсти. Бантинг заявил, что свою половину премии он разделит с Бестом. Маклеод поделился с Колл и пом. История открытия инсулина подробно описана Блиссом (Bliss, 1982).

Строение инсулина [ править | править код ]

Несколько лет спустя Абель получил чистый кристаллический инсулин, но аминокислотная последовательность этого гормона была расшифрована Сэнгером только в I960 г. В 1963 г. был синтезирован искусственный инсулин, а в 1972 г. Ходжкин с коллегами установил его пространственную структуру. Инсулин был первым гормоном, который стали определять с помощью РИА (Yalow, 1978).

Бета-клетки островков поджелудочной железы синтезируют инсулин из препроинсулина — одноцепочечного белка-предшественника, состоящего из 110 аминокислотных остатков. После переноса через мембрану шероховатого эндоплазматического ретикулума от препроинсулина отщепляется кислый N-концевой сигнальный пептид из 24 аминокислотных остатков, и образуется проинсулин (рис. 61.1)

. На этом этапе образуются дисульфидные связи, и молекула приобретает третичную структуру. В аппарате Гольджи от человеческого проинсулина протеазы отщепляют четыре основных аминокислотных остатка и соединительное звено — С-пептид. В результате получаются две пептидные цепи (А и В), вместе составляющие молекулу инсулина. Каждая из цепей содержит по одной дисульфидной связи, между собой они соединены еще двумя. A-цепь обычно содержит 21 аминокислотный остаток, В-цепь — 30; молекулярная масса инсулина равна 5734. Аминокислотная послеловательность инсулина считается консервативной, но в ходе эволюции с ней происходили существенные изменения, отразившиеся на биологической активности и иммуногенности этого гормона (De Meyts, 1994). У большинства видов имеется один ген инсулина, кодирующий один белок. Исключение составляют крысы и мыши, имеющие по два гена инсулина. У них образуются по два инсулина, различающихся двумя аминокислотными остатками В-цепи.

Кристаллическая структура инсулина к настоящему времени изучена с разрешением 0,15 нм. Обе цепи гормона имеют весьма упорядоченную структуру с несколькими а-спиральными участками. По отдельности цепи инсулина биологической активностью не обладают. В растворе инсулин может существовать как мономер, димер или гексамер. Гексамер образуется с участием двух ионов Zn +; полагают, что именно в этой форме инсулин хранится в секреторных гранулах β-клеток. По-видимому, Zn + играет ведущую роль в формировании кристаллов инсулина, а кристаллизация ускоряет процесс превращения проинсулина в инсулин и облегчает хранение гормона. Большинство препаратов инсулина содержат высококонцентрированный раствор гексамеров гормона. После того как препарат инсулина всосался и его концентрация упала до физиологической (наномолярной), гормон распадается на мономеры, которые и обладают биологической активностью. В последнее время появились препараты инсулина, содержащие мономеры гормона.

Значительная часть наших знаний о взаимосвязи структуры и активности инсулина получена при изучении инсулинов различных видов животных, а также путем химических модификаций молекулы гормона. Инвариантные аминокислотные остатки (Гли\ Глу\ Глн5, Тир1’*, Асн21 в A-цепи и Вал12, Тир16, Гли23, Фен24, Фен и Тир26 в В-цепи) образуют структуру, которая взаимодействует с рецептором инсулина (рис. 61.2). Некоторые из этих остатков участвуют и в димеризации инсулина (de Meyts, 1994). Лей13 A-цепи и Лей17 В-цепи, по-видимому, формируют второй участок связывания (de Meyts, 1994). Инсулин связывается с N-концевым и С-концевым участками а-субъеди-ницы рецептора. Полагают, что в связывании участвует и богатый цистеином фрагмент а-субъединицы рецептора. Как правило, сродство инсулина к своему рецептору коррелирует со способностью гормона влиять на метаболизм глюкозы. Бычий и свиной инсулины обладают биологической активностью, равной активности человеческого инсулина, инсулин морских свинок значительно менее активен, а некоторые птичьи инсулины по активности превосходят человеческий.

Инсулин входит в семейство пептидов, называемых инсулиноподобными факторами роста — ИФР. Два из них (ИФР-I и ИФР-П) имеют молекулярную массу около 7500 и по структуре сходны с проинсулином (Cohick and Clemmons, 1993). В молекуле ИФР сохранены участки, тождественные С-пептиду проинсулина. В отличие от инсулина, ИФР продуцируются многими тканями и участвуют в первую очередь в регуляции роста, а не метаболизма. Полагают, что эти пептиды, особенно ИФР-1, опосредуют действие СТГ (раньше их даже называли соматомединами). Не исключено, что релаксин — гормон, секретируемый желтым телом во время беременности, находится в отдаленном родстве с ИФР.

Рецепторы инсулина и ИФР-I тоже сходны по структуре (Duronio and Jacobs, 1988). Поэтому инсулин хоть и с низким сродством, но связывается с рецептором ИФР-I, а ИФР-1 — с рецептором инсулина. Полагают, что стимулирующее действие инсулина на пролиферацию клеток, по крайней мере отчасти, опосредовано рецептором ИФР-I. Метаболическая и митогенная активность аналогов инсулина не всегда коррелируют. Например, метаболическая активность проинсулина в 50 раз меньше, чем инсулина, а митогенная — всего в 2 раза меньше (King and Kahn, 1981). Это нужно учитывать при выборе препарата инсулина, поскольку стимулирующее действие на пролиферацию клеток повышает риск атеросклероза.

Метаболизм инсулина [ править | править код ]

Синтез и секреция [ править | править код ]

Синтез, запасание и секреция инсулина β-клетками, а также инактивация гормона в тканях-мишенях подробно изучены на клеточном и молекулярном уровнях. Более того, эти сведения послужили основой для изучения секреторной активности других островковых клеток (Orci, 1986). Островки поджелудочной железы содержат клетки четырех типов, которые синтезируют и секретируют разные пептидные гормоны: β-клетки — инсулин, а-клетки — глюкагон, 5-клетки — соматостатин, а РР-клетки (они же F-клетки) — панкреатический полипептид. На долю β-клеток приходится 60—80% массы островка, они составляют его ядро. Альфа-, 8- и РР-клетки формируют вокруг ядра мантию толщиной в 1—3 клетки.

Островковые клетки соединены между собой щелевыми контактами, которые пропускают небольшие молекулы и обеспечивают координацию работы клеток (Orci, 1986). Артериола, входя в островок, ветвится и образует в его ядре похожую на клубочек капиллярную структуру. Капилляры выходят в мантию и сливаются там в собирательный сегмент венулы (Вопner-Weir and Orci, 1982). Кровь в островке течет от р-клеток к а-и 5-клеткам (Samols et al., 1986). Таким образом, β-клетки первыми воспринимают концентрацию глюкозы в крови, а остальные типы клеток подвергаются действию чрезвычайно высоких концентраций инсулина.

Как уже говорилось, инсулин образуется из одноцепочечного предшественника, в котором А- и В-цепи соединены С-пеп-тидом. В процессе трансляции возникает препроинсулин, содержащий дополнительно сигнальную последовательность из 24 гидрофобных аминокислотных остатков на N-конце В-цепи. Сигнальная последовательность нужна для проникновения образующегося препроинсулина в просвет шероховатого эндо-плазматического ретикулума, где сигнальная последовательность сразу же отщепляется, а проинсулин в мелких везикулах транспортируется в аппарат Гольджи. Здесь он упаковывается в секреторные гранулы вместе с ферментами, необходимыми для его превращения в инсулин (Orci, 1986).

Превращение проинсулина в инсулин начинается в аппарате Гольджи и продолжается в секреторных гранулах, практически завершаясь к моменту секреции. Таким образом, в кровоток попадают эквимолярные количества С-пептида и инсулина. Какие биологические функции выполняет С-пептид, пока не известно, однако он служит надежным маркером секреции инсулина (Polonsky and Rubenstein, 1986). Кроме того, из β-клеток высвобождаются малые количества проинсулина и дез-31,32-проинсулина. Это может объясняться либо экзоцитозом гранул, в которых превращение проинсулина в инсулин еще не завершилось, либо наличием дополнительного механизма секреции. Поскольку Я проинсулина в кровотоке намного больше, чем Т1/2 инсулина, до 20% иммунореактивного инсулина плазмы на самом деле представляют собой проинсулин и промежуточные продукты его превращения в инсулин.

Превращение проинсулина в инсулин осуществляют две Са2+-зависимые эндопептидазы, обнаруженные в секреторных гранулах островковых и других нейроэндокринных клеток. Эти эндопептидазы — прогормон-конвертазы 2 и 3 — имеют активный центр, сходный с таковым субтилизина, и расщепляют связи Лиз—Apr и Apr—Apr (Steiner et al., 1992). Прогормон-конвертаза 2 расщепляет только место соединения С-пептида с A-цепью. Прогормон-конвертаза 3 расщепляет преимущественно место соединения С-пептида с В-цепью, но может также действовать на точку приложения прогормон-конвертазы 2. Хотя данное семейство эндопротеаз включает в себя как минимум еще два белка (прогормон-конвертазу 1 и фурин), за превращение проинсулина в инсулин ответственны, очевидно, только прогормон-конвертазы 2 и 3.

Регуляция секреции инсулина [ править | править код ]

Секреция инсулина регулируется настолько четко и слаженно, что и натощак, и во время еды в крови поддерживается постоянный уровень глюкозы. В регуляции участвуют питательные вещества, гормоны, вырабатываемые поджелудочной железой и ЖКТ, а также медиаторы вегетативной нервной системы. Глюкоза, аминокислоты, жирные кислоты и кетоновые тела стимулируют секрецию инсулина. Островки поджелудочной железы имеют богатую адренергическую и холинергическую иннервацию. Стимуляция а2-адренорецепторов ведет к подавлению секреции инсулина, а стимуляция β2-адре-норецепторов и блуждающего нерва — к усилению. Любое воздействие, повышающее симпатический тонус (гипоксия, переохлаждение, хирургическое вмешательство, ожоги), сопровождается снижением секреции инсулина за счет активации а2-адренорецепторов. Соответственно, а2-адреноблокаторы увеличивают базальный уровень инсулина в плазме, а β2-адреноблокаторы уменьшают его (Porte and Halter, 1981).

Главным стимулятором секреции инсулина служит глюкоза, ее присутствие необходимо и для действия других стимуляторов (Matschinsky, 1996). Глюкоза сильнее стимулирует секрецию инсулина, когда ее принимают внутрь, чем при в/в введении. Действительно, прием пиши (и в ее составе — глюкозы) ведет к выбросу гормонов ЖКТ и активации блуждающего нерва (Malaisse, 1986; Brelje and Sorenson, 1988). Среди гормонов ЖКТ, стимулирующих секрецию инсулина, ведущая роль принадлежит гастроингибирующему пептиду и глюкагоноподобному пептиду типа 1; менее сильные стимуляторы — гастрин, секретин, хо-лецистокинин, ВИП, гастрин-высвобождающий пептид и оксинтомодулин (Ebert and Creutzfeldt, 1987).

Секреция инсулина, возникающая под действием глюкозы, носит двухфазный характер. Первая фаза достигает максимума через I —2 мин и длится недолго, вторая начинается не сразу, но продолжается длительное время. Механизм, посредством которого глюкоза вызывает секрецию инсулина, до конца не изучен. Первым делом глюкоза должна попасть внутрь β-клеток и метаболизироваться (Matschinsky, 1996).

Глюкоза транспортируется в β-клетки путем облегченной диффузии, в которой участвует мембранный белок — переносчик глюкозы GLUT2 (см. ниже). Внутри клеток глюкоза фосфорилирустся глюкокиназой. В отличие от других гексокиназ, глюкокиназа (гексокиназа типа IV) экспрессируется только в тех клетках, которые участвуют в регуляции метаболизма глюкозы, в частности в гепатоцитах и β-клетках островков поджелудочной железы. Благодаря довольно высокой константе Михаэлиса (10—20 ммоль/л) этот фермент играет важнейшую роль в поддержании нормальной концентрации глюкозы в организме. Способность моно- и дисахаридов подвергаться фосфори-лированию и, следовательно, гликолизу коррелирует с их способностью стимулировать секрецию инсулина. Этот факт позволил предположить, что на самом деле стимулятором секреции инсулина является некий промежуточный продукт гликолиза либо какой-то кофермент (Matschinsky, 1996). Обнаружение мутаций гена глюкокиназы у больных с относительно редкой формой сахарного диабета — юношеским инсулинонезависимым сахарным диабетом типа 2 (MODY2; см. ниже) упрочило гипотезу о том, что глюкокиназа служит своеобразным датчиком концентрации глюкозы. Данные мутации приводят к нарушению способности глюкокиназы фосфорилировать глюкозу и таким образом увеличивают минимальную концентрацию глюкозы, при которой усиливается секреция инсулина (Gidh-Jain et al., 1993).

В конечном счете скорость секреции инсулина определяется внутриклеточной концентрацией Са2+ (Wolfet al., 1988). Метазолизм глюкозы, который начинается с фосфорилирования глюкокиназой, приводит к уменьшению отношения концентраций АТФ и АДФ в клетке. В результате ингибируются АТФ-чувст-вительные калиевые каналы и мембрана β-клетки деполяризуется. Последующее открывание потенциалзависимых кальциевых каналов приводит ко входу Са2+ в клетку. Кальций активирует фосфолипазы А2 и С, и в результате образуются арахидоно-вая кислота, инозитолполифосфаты и ДАГ. ИФ3 способствует мобилизации Са2+ из структур, подобных эндоплазматическому ретикулуму, что вызывает дальнейший подъем внутриклеточной концентрации Са . Ионы кальция непосредственно стимулируют секрецию инсулина.

Подъем внутриклеточной концентрации Са наблюдается также при активации фосфолипазы С ацетилхолином, холецистокинином и гормонами, увеличивающими внутриклеточную концентрацию цАМФ (Ebert and Creutzfeldt, 1987). Глюкагон, гастроингибирующий пептид и глюкагоноподобный пептид типа 1 активируют аденилатциклазу β-клеток (фермент, под действием которого образуется цАМФ), а соматостатин и а2-адреностимуляторы ингибируют ее (Fleischer and Erlichman, 1989).

Большинство питательных веществ и гормонов, стимулирующих секрецию инсулина, усиливают и биосинтез этого гормона (Gold et al., 1982). Хотя синтез и секреция инсулина тесно связаны между собой, существуют факторы, которые влияют на один процесс, не затрагивая другой. Примером может служить снижение внутриклеточной концентрации Са2+, которое ингибирует секрецию, но не влияет на синтез инсулина.

Скорости секреции инсулина и глюкагона осгровковыми клетками обычно находятся в обратной зависимости друг от друга (Unger, 1985). Это связано с действием на а-клетки инсулина, а также глюкозы и других веществ (см. ниже). Кроме того, секрецию и инсулина, и глюкагона модулирует соматостатин — третий островковый гормон (см. ниже). Глюкагон вызывает выброс соматостатина, а соматостатин подавляет секрецию инсулина, что в физиологических условиях большой роли не играет. Кровь в островках течет от р-клеточного ядра к а- и 5-клеткам (Samols et al., 1986), поэтому инсулин может паракринно ингибировать секрецию глюкагона, а вот соматостатин, чтобы попасть к а- и β-клеткам, должен пройти оба круга кровообращения. Таким образом, инсулин регулирует секрецию глюкагона и панкреатического полипептида, тогда как роль соматосгатина остается неясной.

Распределение и инактивация [ править | править код ]

В крови инсулин находится в виде ни с чем не связанного мономера, и его объем распределения приближается к объему внеклеточной жидкости. Натощак из поджелудочной железы в воротную вену поступает около 40 мкг (1 ед) инсулина в час. При этом в воротной вене концентрация инсулина составляет 2—4 нг/мл (50—100 мкед/мл), а в периферической крови — 0,5 нг/мл (12 мкед/мл), или примерно 0,1 нмоль/л. После приема пиши концентрация инсулина в воротной вене быстро возрастает, вслед за чем наблюдается параллельный, но меньший по амплитуде подъем концентрации инсулина в периферической крови. Задача инсулинотерапии — воспроизвести эту картину, однако с помощью п/к инъекций гормона добиться этого очень и очень трудно.

Т1/2 инсулина в плазме у здоровых людей и больных с неосложненным сахарным диабетом составляет 5—6 мин (Sodoyez et al„ 1983). У больных сахарным диабетом, имеющих антитела к инсулину, эта цифра бывает несколько выше. Т,/2 проинсулина дольше и составляет примерно 17 мин; на долю проинсулина приходится около 10% всего иммунореактивного инсулина плазмы (Robbins et al., 1984). У больных с инсулиномой доля проинсулина в крови обычно увеличена и достигает 80% иммунореактивного инсулина плазмы. Поскольку биологическая активность проинсулина составляет около 2% активности инсулина, истинная концентрация гормона всегда несколько ниже той, которую дают неспецифичные РИА и иммуноферментный анализ. С-пептид секретируется вместе с инсулином в эквимолярных количествах, но его молярная концентрация в плазме выше концентрации инсулина — за счет меньшего печеночного клиренса и длительного Т1/2 (около 30 мин) (Robbins et al., 1984). По концентрации С-пептида в крови судят о стимулированной секреции инсулина.

Инактивация инсулина осуществляется преимущественно в печени, почках и мышцах (Duckworth, 1988). Примерно половина инсулина, достигающего печени через воротную вену, разрушается гепатоцитами и не попадает в системный кровоток. Инсулин фильтруется в почечных клубочках и реабсорбируется в почечных канальцах, что тоже приводит к его разрушению. Тяжелая почечная недостаточность влияет на ТЦ инсулина даже в большей степени, чем заболевания печени (Rabkin et al., 1984). Дело в том, что гепатоциты и в норме инактивируют инсулин с максимальной скоростью, поэтому возможности скомпенсировать утраченную функцию почек у них нет. Прием глюкозы внутрь, похоже, приводит к снижению поглощения инсулина печенью (Hanks et al.,1984). Периферические ткани, в частности жировая, тоже инактивируют инсулин, но в малых количествах.

Протеолиз инсулина в печени происходит главным образом внутри гепатоцитов (после интернализации гормон-рецепторного комплекса), и лишь малая часть инсулина расщепляется на поверхности клеток (Berman et al., 1980). Интернализация гормон-рецепторного комплекса осуществляется путем эндоцитоза, во время которого комплекс попадает в мелкие везикулы, называемые эндо-сомами. В них и начинается разрушение инсулина (Duckworth, 1988). Некоторое количество гормона разрушается в лизосомах.

Доля инсулина, разрушаемого после интернализации, зависит от типа клеток. Так, в гепатоцитах расщепляется более 50% попавшего внутрь клеток инсулина, а эндотелиальные клетки высвобождают неизмененным почти весь поглощенный ими гормон. По-видимому, инсулин просто транспортируется эндотелиальными клетками из крови во внеклеточное пространство (King and Johnson,1985). Там, где эндотелиальные клетки соединены между собой плотными контактами (в частности, в мышечной и жировой ткани), такой транспорт, называемый трансцитозом, играет важнейшую роль в доставке инсулина к клеткам-мишеням.

В расщеплении инсулина участвуют несколько ферментов. Главный из них — цистеиновая металлопротеиназа, содержащаяся в гепатоцитах (Shii and Roth, 1986). Иммунологически сходные с ней белки обнаружены в мышцах, почках и головном мозге (Duckworth, 1988). Наибольшую активность по расщеплению инсулина проявляет цитозоль, поэтому возникает вопрос, каким же образом цитозольный фермент действует на заключенный в везикулы инсулин. В то же время эта активность обнаружена и в эндосомах (Hamel et al., 1991). Описан и другой фермент, расщепляющий инсулин (Authieret al., 1994). Распределение ролей между двумя ферментами остается под вопросом. Не исключено, что оба они участвуют в инактивации и других гормонов, в частности глюкагона.

Источник статьи: http://sportwiki.to/%D0%93%D0%BE%D1%80%D0%BC%D0%BE%D0%BD_%D0%B8%D0%BD%D1%81%D1%83%D0%BB%D0%B8%D0%BD

bezinsulina