В биохимическом анализе повышен инсулин

В биотехнологии гормон роста и человеческий инсулин получают путем

Тест по биологии для 11 класса по теме «Железы внутренней секреции»

Устанавливая рекомендуемое программное обеспечение вы соглашаетесь
с лицензионным соглашением Яндекс.Браузера и настольного ПО Яндекса .

Тренажёр для подготовки к ЕГЭ

Железы внешней, внутренней и смешанной секреции.

1. Железы внешней, внутренней и смешанной секреции.

Железы – органы, вырабатывающие биологически активные вещества, с помощью которых осуществляется гуморальная регуляция. Их делят на две группы: внешней (экзокринные) и внутренней (эндокринные) секреции. Экзокринные железы имеют выводные протоки, через которые выделяют свой секрет на поверхность слизистых оболочек или кожи (слюнные железы, железы желудка, кишечника, печень, молочные, сальные, потовые и др.). Эндокринные железы не имеют выводных протоков и выделяют свой секрет (гормоны) в кровь и лимфу (гипофиз, щитовидная, паращитовидные железы, надпочечники, эпифиз, вилочковая железа). Кроме того, существуют железы смешанной секреции, осуществляющие и внешнесекреторную, и внутрисекреторную функции (половые и поджелудочная).

Биологически активные вещества — химические вещества, очень малые концентрации, которых способны оказать значительное физиологическое действие. Биологически активные вещества, выделяемые железами внутренней секреции, называются гормонами . По химической природе гормоны делятся на три группы: полипептиды и белки (инсулин); аминокислоты и их производные (тироксин, адреналин); стероиды (половые гормоны). Гормоны циркулируют в крови в свободном состоянии и в виде соединений с белками. Связанные с белками гормоны, как правило, переходят в неактивную форму. Для гормонов характерны строгая специфичность действия, высокая биологическая активность и дистантный характер действия (органы и системы, на которые действуют гормоны, расположены далеко от места их образования). Гормоны могут оказывать своё влияние различными путями: через нервную систему, гуморально, непосредственно воздействуя на органы и ткани.

Функции гормонов (эндокринной системы): регуляция и интеграция функций организма, поддержание гомеостаза, обеспечение адаптации организма к меняющимся условиям внешней среды.

В гуморальной регуляции принимает участие гипофиз, находящийся в полости черепа и анатомически и функционально связанный с головным мозгом. Это важнейшая железа внутренней секреции, массой 0,5-0,7 г, вырабатывает гормоны, которые влияют на регулирующие функции многих других желез внутренней секреции-щитовидной железы, надпочечников, половых желез.

На шее впереди гортани расположена щитовидная железа. Она вырабатывает ряд гормонов, которые участвуют в регуляции процессов роста, развития, дифференцировки тканей. Они повышают интенсивность обмена веществ, уровень потребления кислорода органами и тканями.

Околощитовидные железы расположены на задней поверхности щитовидной железы. Этих желез четыре, они очень маленькие, общая их масса составляет всего 0,1-0,13 г. Гормон этих желез регулирует содержание солей кальция и фосфора в крови, при недостатке этого гормона нарушается рост костей, зубов, повышается возбудимость нервной системы.

Парные надпочечники расположены, как видно из их названия, над почками. Они выделяют несколько гормонов, которые регулируют обмен углеводов, жиров, влияют на содержание в организме натрия, калия, стимулируют деятельность сердечнососудистой системы.

Поджелудочная железа выделяет пищеварительный сок, поступающий в двенадцати перстную кишку; одновременно отдельные её клетки функционируют как железы внутренней секреции, вырабатывая гормон инсулин, регулирующий обмен углеводов в организме. Снижение выработки инсулина приводит к тому, что большая часть углеводов выводится из организма с мочой. Это приводит к развитию такого заболевания, как диабет.

Половые железы вырабатывают гормоны, регулирующие рост и созревание организма, формирование вторичных половых признаков. Половые гормоны обусловливают развитие половых органов, образование половых клеток, у женщин управляют фазами полового цикла, течением беременности.

Часть 1 содержит 10 заданий (А1-А10). К каждому заданию приводится 4 варианта ответа, один из которых верный.

Биотехнология получения инсулина, гормона роста и интерферона

Инсулин – гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному из тяжелейших заболеваний – сахарному диабету, который как причина смерти стоит на третьем месте после сердечно-сосудистых заболеваний и рака. Инсулин – небольшой глобулярный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Синтезируется он в виде одноцепочного предшественника – проинсулина, содержащего концевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С-пептид). При удалении сигнального пептида в клетке образуется проинсулин из 86 аминокислотных остатков, в котором А и В-цепи инсулина соединены С-пептидом, обеспечивающим им необходимую ориентацию при замыкании дисульфидных связей. После протеолитического отщепления С-пептида образуется инсулин.

Известно несколько форм сахарного диабета. Самая тяжёлая форма, для лечения которой больному необходим инсулин (инсулинзависимая форма заболевания), вызвана избирательной гибелью клеток, синтезирующих этот гормон (клетки островков Лангерганса в поджелудочной железе). Форма сахарного диабета, для лечения которой инсулин не требуется, распространена чаще, с ней удаётся справляться с помощью соответствующих диет и режима.

Обычно поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиней не используется в мясной и консервной промышленности и поставляется в вагонах-рефрижераторах на фармацевтические предприятия, где проводят экстракцию гормона. Для получения 100 г кристаллического инсулина необходимо 800-1000 г исходного сырья.

Синтез обеих цепей и соединение их дисульфидными связями для получения инсулина были проведены в 1963 и 1965 гг тремя коллективами исследователей в США, Китае и Германии. В 1980 г датская компания «Ново индастри» разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека путём замещения 30-го остатка аланина в цепи В на остаток треонина. Оба инсулина не различались по активности и длительности действия.

Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 30 лет назад. В 1978 году появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках E. Coli (рис. 8.21):

1.Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к 3′-концу гена фермента в-галактозидазы и вводился в векторную плазмиду — pBR322 (1).

2. Клетки E. Coli, трансформированные такими рекомбинантными плазмидами, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента в-галактозидазы и А и В пептида инсулина, присоединённого к ней через остаток метионина (2).

3. После обработки химерного белка бромцианом и протеолитического отщепления С-пептида образуется инсулин.

Рис. 8.21. Схема синтеза инсулина

Синтез соматотропина (гормона роста или ГР).

Соматотропин секретируется передней долей гипофиза. Впервые он был выделен (и очищен) в 1963 г из гипофиза. Его недостаток приводит к заболеванию – гипофизарной карликовости (1 случай на 5000 человек). Гормон обладает видовой специфичностью. Обычно его получают из гипофиза забитых на мясокомбинате животных, но в недостаточном количестве. Гормона хватает лишь для лечения 1/3 случаев гипофизарной карликовости и лишь в развитых странах. Основные производители – Швеция, Италия, Швейцария и США. Молекула ГР человека состоит из 191 аминокислотного остатка.

Принимая во внимание это обстоятельство, в настоящее время ГР синтезируют методами гинетической инженерии в специально сконструированных клетках бактерий. Будучи синтезированным в клетках E. Coli, ГР содержит дополнительный остаток метионина на H2N-конце молекулы. Биосинтез гормона роста из 191 аминокислотного остатка был впервые осуществлён в 1979 году Д. Гедделем с сотрудниками. Сначала клонировали двунитевую кДНК; далее путём расщепления получали последовательность, кодирующую аминокислотный порядок гормона, за исключением первых 23 аминокислот и синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от первой до двадцать третьей, со стартовым ATG-кодоном в начале. Затем два фрагмента объединяли и подстраивали к паре lac-промоторов и участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры, что составляет 1000 000 молекул гормона на клетку.

Полученный гормон на конце полипептидной цепи содержал дополнительный остаток метионина и обладал значительной биологической активностью. С 1984 г после многолетних клинических испытаний на токсичность компанией «Генетек» (Сан-Франциско) было начато широкомасштабное производство бактериального соматотропина.

ГР в клетках E. Coli и в культуре клеток животных был получен в 1984 году одновременно в институте Пастера (Париж) и в Институте молекулярной биологии (Москва). Оказалось, что в бактериальных клетках возможен синтез аналогов ГР, с помощью которых изучались участки молекулы, важные для стимулирования роста и процесса неоглюкогенеза на молекулярном уровне.

Огромный интерес представляют выделение и промышленный синтез полипептида, аналога гипоталамического релизинг-фактора соматотропина (СТГ-РФ). Введение этого фактора способно компенсировать недостаток соматотропина. Таким образом, наличие СТГ-РФ и самого гормона, полученных в генетически сконструированных бактериальных клетках, очень важно для успешного лечения заболеваний, таких, как карликовость (для увеличения живой массы и ускорения роста человека и животных), всех форм диабета, регенерации тканей после ожогов и др. Это происходит за счёт того что он, не обладая видовой специфичностью, способен стимулировать освобождение гормона роста у человека и животных.

В селекции крупного рогатого скота перенос гена соматотропина позволяет, по оценке учёных: 1. Увеличить молочную продуктивность и живую массу животных; 2. Повысить содержание белка в молоке и мясе. Научный интерес к действию соматотропина на лактацию млекопитающих проявился ещё более 70 лет назад. Первые работы поизучению влияния соматотропина на молочную продуктивность коров были осуществлены в России ещё в 1937 г (Азимов Г., 1937). В этих исследованиях впервые было показано, что введение неочищенного экстракта из гипофиза приводит к повышению молочной продуктивности лактирующих коров на 8%. Однако сложность очистки этого гормона и весьма ограниченные возможности его производства не позволяли провести широкие исследования по изучению механизмов его действия на молочную продуктивность. И только позднее в экспериментах с использованием соматотропина крупного рогатого скота тонкой очистки было установлено, что ежедневное введение экзогенного гормона приводило к повышению надоев молока на 10-40%. Однако в этих опытах увеличение надоев молока отмечалось лишь в первые 14-16 дней (Banman D., Mc-Cutehon S., 1985).

Известно, что гормон роста, действуя на поверхностные рецепторы клетки, повышает в них синтез белка. Опыты по использованию соматотропина на молочных коровах показали, что, имеется тесная связь между действием гена этого гормона и продуктивностью. Фирма «Монсанто», которая разработала генно-инженерный способ синтеза гормона роста крупного рогатого скота доказала его эффективность (2002 г). При этом отмечается, что самый большой вклад в увеличение продуктивности может дать использование именно этого гормона. Предполагается, что в США к 2018 году этот гормон будут получать 50% коров. Наряду с усовершенствованными технологиями применение гормона позволит повысить средний удой молока от коровы к 2020 году до 9281кг и сократить число коров на 20%.

Интерферон был открыт в 1957 году в Национальном институте медицинских исследований в Лондоне, как факторы устойчивости к вирусной инфекции. Было установлено, что клетки животных, подвергнутых воздействию вируса, выделяют в среду фактор, способный придавать свежим клеткам устойчивость к вирусной инфекции. Он препятствовал (интерферировал) размножению вирусов в клетке и, в силу этой способности, был назван интерфероном.

Известны три группы интерферонов:

1. α (альфа-интерфероны, α-И), образующиеся при воздействии вирусов на лейкоциты;

2. β (бета-интерфероны, β-И), появляющиеся при воздействии вирусов на фибробласты;

3. λ (гамма-интерфероны, λ-И), продуцируемые Т-лимфоцитами в ответ на воздействие бактериальными и вирусными антигенами или антисыворотками против поверхностных детерминант лимфоцитов.

Интерфероны широко используются для лечения различных тяжёлых заболеваний – острого вирусного гепатита, рассеянного склероза, остеосаркомы, миеломы, ряда опухолей гортани, лёгких и мозга.

С учётом видоспецифичности интерферонов, предназначенных для лечения, необходимы такие препараты, которые получены из клеток человека и животных. Традиционно их извлекают из крови человека и животных (из 1 л крови можно выделить всего 1 мкг интерферона, т. е. одну дозу для инъекции). До последнего времени бόльшая часть мирового производства интерферонов осуществлялась в Финляндии и Франции. С 1990 года одна из японских компаний наладила производство лимфобластоидного интерферона из лимфобластоидных клеток. С этой целью культура данных клеток индуцировалась вирусом Сендай, после чего интерферон выделяли с помощью хроматографических колонок, заполненных моноклональными антителами против получаемого интерферона. В Швеции лабробласты выращивали в ферментёрах объёмом 2000 л; полученные интерфероны очищали с помощью моноклональных антител.

Из всех видов интерферонов для мирового производства наиболее пригоден β-И. Фибробласты, получаемые из тканей плода, можно поддерживать в культуре клеток, что даёт возможность массового производства. Метод получения β-интерферона был разработан в Англии.

Выше перечисленные методы получения интерферонов характеризуются низким выходом, высокой стоимостью и недостаточной чистотой препарата. На современном этапе наиболее перспективный метод – биосинтез интерферонов с помощью генетически сконструированных микроорганизмов. ДНК, полученные обратным траскрибированием, были клонированы в E. Coli (рис. 8.23). Это явилось революционным событием в теоретических и прикладных исследованиях интерферонов. Метод состоит из следующих элементов:

1. Ген интерферона от человека встраивают в векторную ДНК; 2. Присоединяют к нему бактериальные регуляторные элементы, программирующие его транскрипцию и трансляцию в бактериальной клетке.

Установлено, что интерфероны синтезируются в клетке сначала в виде предшественников, содержащих на N-конце полипептидной цепи сигнальный пептид, который затем отщепляется и, в результате, образуется зрелый интерферон, обладающий полной биологической активностью. Бактерии не содержат ферментов, способных отщепить сигнальный пептид с образованием зрелого белка. Для того чтобы бактерии синтезировали зрелый интерферон, следует ввести в плазмиду только ту часть гена, которая его кодирует, и удалить часть гена, кодирующую сигнальный пептид. Процедура требует соблюдения следующих условий:

Рис. 8.23. Схема рекомбинантной плазмиды,

Дата добавления: 2016-05-28 ; просмотров: 4590 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

Биотехнология в животноводстве

Инсулин – гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному из тяжелейших заболеваний – сахарному диабету, который как причина смерти стоит на третьем месте после сердечно-сосудистых заболеваний и рака. Инсулин – небольшой глобулярный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Синтезируется он в виде одноцепочного предшественника – проинсулина, содержащего концевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С-пептид). При удалении сигнального пептида в клетке образуется проинсулин из 86 аминокислотных остатков, в котором А и В-цепи инсулина соединены С-пептидом, обеспечивающим им необходимую ориентацию при замыкании дисульфидных связей. После протеолитического отщепления С-пептида образуется инсулин.
Известно несколько форм сахарного диабета. Самая тяжёлая форма, для лечения которой больному необходим инсулин (инсулинзависимая форма заболевания), вызвана избирательной гибелью клеток, синтезирующих этот гормон (клетки островков Лангерганса в поджелудочной железе). Форма сахарного диабета, для лечения которой инсулин не требуется, распространена чаще, с ней удаётся справляться с помощью соответствующих диет и режима.
Обычно поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиней не используется в мясной и консервной промышленности и поставляется в вагонах-рефрижераторах на фармацевтические предприятия, где проводят экстракцию гормона. Для получения 100 г кристаллического инсулина необходимо 800-1000 г исходного сырья.
Синтез обеих цепей и соединение их дисульфидными связями для получения инсулина были проведены в 1963 и 1965 гг тремя коллективами исследователей в США, Китае и Германии. В 1980 г датская компания «Ново индастри» разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека путём замещения 30-го остатка аланина в цепи В на остаток треонина. Оба инсулина не различались по активности и длительности действия.
Работы
по генно-инженерному получению инсулина начались около 30 лет назад. В 1978 году появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках E. Coli (рис. 8.21):
1. Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к 3′-концу гена фермента в-галактозидазы и вводился в векторную плазмиду — pBR322 (1).
2. Клетки E. Coli, трансформированные такими рекомбинантными плазмидами, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента в-галактозидазы и А и В пептида инсулина, присоединённого к ней через остаток метионина (2).
3. После обработки химерного белка бромцианом и протеолитического отщепления С-пептида образуется инсулин.

Рис. 8.21. Схема синтеза инсулина

Синтез соматотропина (гормона роста или ГР).

Интерферон был открыт в 1957 году в Национальном институте медицинских исследований в Лондоне, как факторы устойчивости к вирусной инфекции. Было установлено, что клетки животных, подвергнутых воздействию вируса, выделяют в среду фактор, способный придавать свежим клеткам устойчивость к вирусной инфекции. Он препятствовал (интерферировал) размножению вирусов в клетке и, в силу этой способности, был назван интерфероном.
Известны три группы интерферонов:
1. α (альфа-интерфероны, α-И), образующиеся при воздействии вирусов на лейкоциты;
2. β (бета-интерфероны, β-И), появляющиеся при воздействии вирусов на фибробласты;
3. λ (гамма-интерфероны, λ-И), продуцируемые Т-лимфоцитами в ответ на воздействие бактериальными и вирусными антигенами или антисыворотками против поверхностных детерминант лимфоцитов.
Интерфероны широко используются для лечения различных тяжёлых заболеваний – острого вирусного гепатита, рассеянного склероза, остеосаркомы, миеломы, ряда опухолей гортани, лёгких и мозга.
С учётом видоспецифичности интерферонов, предназначенных для лечения, необходимы такие препараты, которые получены из клеток человека и животных. Традиционно их извлекают из крови человека и животных (из 1 л крови можно выделить всего 1 мкг интерферона, т. е. одну дозу для инъекции). До последнего времени бόльшая часть мирового производства интерферонов осуществлялась в Финляндии и Франции. С 1990 года одна из японских компаний наладила производство лимфобластоидного интерферона из лимфобластоидных клеток. С этой целью культура данных клеток индуцировалась вирусом Сендай, после чего интерферон выделяли с помощью хроматографических колонок, заполненных моноклональными антителами против получаемого интерферона. В Швеции лабробласты выращивали в ферментёрах объёмом 2000 л; полученные интерфероны очищали с помощью моноклональных антител.
Из всех видов интерферонов для мирового производства наиболее пригоден β-И. Фибробласты, получаемые из тканей плода, можно поддерживать в культуре клеток, что даёт возможность массового производства. Метод получения β-интерферона был разработан в Англии.
Выше перечисленные методы получения интерферонов характеризуются низким выходом, высокой стоимостью и недостаточной чистотой препарата. На современном этапе наиболее перспективный метод – биосинтез интерферонов с помощью генетически сконструированных микроорганизмов. ДНК, полученные обратным траскрибированием, были клонированы в E. Coli (рис. 8.23). Это явилось революционным событием в теоретических и прикладных исследованиях интерферонов. Метод состоит из следующих элементов:
1. Ген интерферона от человека встраивают в векторную ДНК; 2. Присоединяют к нему бактериальные регуляторные элементы, программирующие его транскрипцию и трансляцию в бактериальной клетке.
Установлено, что интерфероны синтезируются в клетке сначала в виде предшественников, содержащих на N-конце полипептидной цепи сигнальный пептид, который затем отщепляется и, в результате, образуется зрелый интерферон, обладающий полной биологической активностью. Бактерии не содержат ферментов, способных отщепить сигнальный пептид с образованием зрелого белка. Для того чтобы бактерии синтезировали зрелый интерферон, следует ввести в плазмиду только ту часть гена, которая его кодирует, и удалить часть гена, кодирующую сигнальный пептид. Процедура требует соблюдения следующих условий:

Рис. 8.23. Схема рекомбинантной плазмиды, при синтезе интерферона человека в E. C oli

Биотехнология получения инсулина, гормона роста и интерферона

Инсулин – гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному из тяжелейших заболеваний – сахарному диабету, который как причина смерти стоит на третьем месте после сердечно-сосудистых заболеваний и рака. Инсулин – небольшой глобулярный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Синтезируется он в виде одноцепочного предшественника – проинсулина, содержащего концевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С-пептид). При удалении сигнального пептида в клетке образуется проинсулин из 86 аминокислотных остатков, в котором А и В-цепи инсулина соединены С-пептидом, обеспечивающим им необходимую ориентацию при замыкании дисульфидных связей. После протеолитического отщепления С-пептида образуется инсулин.

Известно несколько форм сахарного диабета. Самая тяжёлая форма, для лечения которой больному необходим инсулин (инсулинзависимая форма заболевания), вызвана избирательной гибелью клеток, синтезирующих этот гормон (клетки островков Лангерганса в поджелудочной железе). Форма сахарного диабета, для лечения которой инсулин не требуется, распространена чаще, с ней удаётся справляться с помощью соответствующих диет и режима.

Обычно поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиней не используется в мясной и консервной промышленности и поставляется в вагонах-рефрижераторах на фармацевтические предприятия, где проводят экстракцию гормона. Для получения 100 г кристаллического инсулина необходимо 800-1000 г исходного сырья.

Синтез обеих цепей и соединение их дисульфидными связями для получения инсулина были проведены в 1963 и 1965 гг тремя коллективами исследователей в США, Китае и Германии. В 1980 г датская компания «Ново индастри» разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека путём замещения 30-го остатка аланина в цепи В на остаток треонина. Оба инсулина не различались по активности и длительности действия.

Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 30 лет назад. В 1978 году появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках E. Coli (рис. 8.21):

1.Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к 3′-концу гена фермента в-галактозидазы и вводился в векторную плазмиду — pBR322 (1).

2. Клетки E. Coli, трансформированные такими рекомбинантными плазмидами, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента в-галактозидазы и А и В пептида инсулина, присоединённого к ней через остаток метионина (2).

3. После обработки химерного белка бромцианом и протеолитического отщепления С-пептида образуется инсулин.

Рис. 8.21. Схема синтеза инсулина

Синтез соматотропина (гормона роста или ГР).

Соматотропин секретируется передней долей гипофиза. Впервые он был выделен (и очищен) в 1963 г из гипофиза. Его недостаток приводит к заболеванию – гипофизарной карликовости (1 случай на 5000 человек). Гормон обладает видовой специфичностью. Обычно его получают из гипофиза забитых на мясокомбинате животных, но в недостаточном количестве. Гормона хватает лишь для лечения 1/3 случаев гипофизарной карликовости и лишь в развитых странах. Основные производители – Швеция, Италия, Швейцария и США. Молекула ГР человека состоит из 191 аминокислотного остатка.

Принимая во внимание это обстоятельство, в настоящее время ГР синтезируют методами гинетической инженерии в специально сконструированных клетках бактерий. Будучи синтезированным в клетках E. Coli, ГР содержит дополнительный остаток метионина на H2N-конце молекулы. Биосинтез гормона роста из 191 аминокислотного остатка был впервые осуществлён в 1979 году Д. Гедделем с сотрудниками. Сначала клонировали двунитевую кДНК; далее путём расщепления получали последовательность, кодирующую аминокислотный порядок гормона, за исключением первых 23 аминокислот и синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от первой до двадцать третьей, со стартовым ATG-кодоном в начале. Затем два фрагмента объединяли и подстраивали к паре lac-промоторов и участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры, что составляет 1000 000 молекул гормона на клетку.

Полученный гормон на конце полипептидной цепи содержал дополнительный остаток метионина и обладал значительной биологической активностью. С 1984 г после многолетних клинических испытаний на токсичность компанией «Генетек» (Сан-Франциско) было начато широкомасштабное производство бактериального соматотропина.

ГР в клетках E. Coli и в культуре клеток животных был получен в 1984 году одновременно в институте Пастера (Париж) и в Институте молекулярной биологии (Москва). Оказалось, что в бактериальных клетках возможен синтез аналогов ГР, с помощью которых изучались участки молекулы, важные для стимулирования роста и процесса неоглюкогенеза на молекулярном уровне.

Огромный интерес представляют выделение и промышленный синтез полипептида, аналога гипоталамического релизинг-фактора соматотропина (СТГ-РФ). Введение этого фактора способно компенсировать недостаток соматотропина. Таким образом, наличие СТГ-РФ и самого гормона, полученных в генетически сконструированных бактериальных клетках, очень важно для успешного лечения заболеваний, таких, как карликовость (для увеличения живой массы и ускорения роста человека и животных), всех форм диабета, регенерации тканей после ожогов и др. Это происходит за счёт того что он, не обладая видовой специфичностью, способен стимулировать освобождение гормона роста у человека и животных.

В селекции крупного рогатого скота перенос гена соматотропина позволяет, по оценке учёных: 1. Увеличить молочную продуктивность и живую массу животных; 2. Повысить содержание белка в молоке и мясе. Научный интерес к действию соматотропина на лактацию млекопитающих проявился ещё более 70 лет назад. Первые работы поизучению влияния соматотропина на молочную продуктивность коров были осуществлены в России ещё в 1937 г (Азимов Г., 1937). В этих исследованиях впервые было показано, что введение неочищенного экстракта из гипофиза приводит к повышению молочной продуктивности лактирующих коров на 8%. Однако сложность очистки этого гормона и весьма ограниченные возможности его производства не позволяли провести широкие исследования по изучению механизмов его действия на молочную продуктивность. И только позднее в экспериментах с использованием соматотропина крупного рогатого скота тонкой очистки было установлено, что ежедневное введение экзогенного гормона приводило к повышению надоев молока на 10-40%. Однако в этих опытах увеличение надоев молока отмечалось лишь в первые 14-16 дней (Banman D., Mc-Cutehon S., 1985).

Известно, что гормон роста, действуя на поверхностные рецепторы клетки, повышает в них синтез белка. Опыты по использованию соматотропина на молочных коровах показали, что, имеется тесная связь между действием гена этого гормона и продуктивностью. Фирма «Монсанто», которая разработала генно-инженерный способ синтеза гормона роста крупного рогатого скота доказала его эффективность (2002 г). При этом отмечается, что самый большой вклад в увеличение продуктивности может дать использование именно этого гормона. Предполагается, что в США к 2018 году этот гормон будут получать 50% коров. Наряду с усовершенствованными технологиями применение гормона позволит повысить средний удой молока от коровы к 2020 году до 9281кг и сократить число коров на 20%.

Интерферон был открыт в 1957 году в Национальном институте медицинских исследований в Лондоне, как факторы устойчивости к вирусной инфекции. Было установлено, что клетки животных, подвергнутых воздействию вируса, выделяют в среду фактор, способный придавать свежим клеткам устойчивость к вирусной инфекции. Он препятствовал (интерферировал) размножению вирусов в клетке и, в силу этой способности, был назван интерфероном.

Известны три группы интерферонов:

1. α (альфа-интерфероны, α-И), образующиеся при воздействии вирусов на лейкоциты;

2. β (бета-интерфероны, β-И), появляющиеся при воздействии вирусов на фибробласты;

3. λ (гамма-интерфероны, λ-И), продуцируемые Т-лимфоцитами в ответ на воздействие бактериальными и вирусными антигенами или антисыворотками против поверхностных детерминант лимфоцитов.

Интерфероны широко используются для лечения различных тяжёлых заболеваний – острого вирусного гепатита, рассеянного склероза, остеосаркомы, миеломы, ряда опухолей гортани, лёгких и мозга.

С учётом видоспецифичности интерферонов, предназначенных для лечения, необходимы такие препараты, которые получены из клеток человека и животных. Традиционно их извлекают из крови человека и животных (из 1 л крови можно выделить всего 1 мкг интерферона, т. е. одну дозу для инъекции). До последнего времени бόльшая часть мирового производства интерферонов осуществлялась в Финляндии и Франции. С 1990 года одна из японских компаний наладила производство лимфобластоидного интерферона из лимфобластоидных клеток. С этой целью культура данных клеток индуцировалась вирусом Сендай, после чего интерферон выделяли с помощью хроматографических колонок, заполненных моноклональными антителами против получаемого интерферона. В Швеции лабробласты выращивали в ферментёрах объёмом 2000 л; полученные интерфероны очищали с помощью моноклональных антител.

Из всех видов интерферонов для мирового производства наиболее пригоден β-И. Фибробласты, получаемые из тканей плода, можно поддерживать в культуре клеток, что даёт возможность массового производства. Метод получения β-интерферона был разработан в Англии.

Выше перечисленные методы получения интерферонов характеризуются низким выходом, высокой стоимостью и недостаточной чистотой препарата. На современном этапе наиболее перспективный метод – биосинтез интерферонов с помощью генетически сконструированных микроорганизмов. ДНК, полученные обратным траскрибированием, были клонированы в E. Coli (рис. 8.23). Это явилось революционным событием в теоретических и прикладных исследованиях интерферонов. Метод состоит из следующих элементов:

1. Ген интерферона от человека встраивают в векторную ДНК; 2. Присоединяют к нему бактериальные регуляторные элементы, программирующие его транскрипцию и трансляцию в бактериальной клетке.

Установлено, что интерфероны синтезируются в клетке сначала в виде предшественников, содержащих на N-конце полипептидной цепи сигнальный пептид, который затем отщепляется и, в результате, образуется зрелый интерферон, обладающий полной биологической активностью. Бактерии не содержат ферментов, способных отщепить сигнальный пептид с образованием зрелого белка. Для того чтобы бактерии синтезировали зрелый интерферон, следует ввести в плазмиду только ту часть гена, которая его кодирует, и удалить часть гена, кодирующую сигнальный пептид. Процедура требует соблюдения следующих условий:

Рис. 8.23. Схема рекомбинантной плазмиды,

Биосинтез соматотропина и других гормонов человека. Получение интерферонов

Биосинтез соматотропина и других гормонов человека

Гормон роста человека, или соматотропин, синтезируется в головном мозге человека в передней доли гипофиза. Впервые он был выделен из трупного материала и очищен в 1963 г. При недостатке соматотропина развивается гипофизарная карликовость, частота встречаемости которой оценивается от 7 до 10 случаев на миллион человек.

Гормон обладает видовой специфичностью, т. е. в отличие от инсулина гормоны роста животных не имеют активности в организме человека. Следовательно, единственным средством излечения гипофизарной карликовости является гормон гипофиза, который выделяли из трупов. Исследования показали, что при внутримышечном введении соматотропина в дозах 10 мг на 1 кг массы в течение года по три инъекции в неделю дает увеличение роста примерно на 8-18 см в год.

Больные дети четырех-пяти лет при непрерывном лечении догоняли в росте своих сверстников к половой зрелости (14-16 лет). Если учесть тот факт, что из одного трупа можно получить 4-6 мг соматотропина, то можно понять, что лечение этого заболевания природным соматотропином — дело совершенно безнадежное. Помимо недостатка препарата возникли и другие проблемы, связанные с гетерогенностью гормона, выделяемого из трупного материала.

Существовала также опасность, что гипофизарный материал заражен медленно развивающимися вирусами. Такие вирусы обладают необычайно длительным инкубационным периодом, поэтому дети, получавшие препарат, нуждались в многолетнем медицинском наблюдении.

Гормон роста человека, синтезированный в специально сконструированных клетках бактерий, имеет очевидные преимущества: он доступен в больших количествах, его препараты являются биохимически чистыми и свободны от вирусных загрязнений.

Биосинтез соматотропина (состоящего из 191-го аминокислотного остатка) специально сконструированными бактериями на основе кишечной палочки был осуществлен фирмой «Генентек». Поскольку при синтезе ДНК на и-РНК получается ген, кодирующий предшественник соматотропина, не расщепляющийся в бактериальных клетках с образованием активного гормона, то поступили следующим образом: на 1 этапе клонировали двунитевую ДНК-копию и-РНК и расщеплением рестрикционными эндонуклеазами получили последовательность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормона, кроме 23-х первых аминокислот. Затем клонировали синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от 1-й до 23-й. Далее два фрагмента объединили вместе и «подстроили» в плазмиду E. coli, после чего клетки бактерии начали синтезировать этот гормон.

К 1980 г. были закончены клинические испытания препарата и тесты на токсичность и были начаты массовые эксперименты на детях, близких по возрасту к половой зрелости. Результаты были обнадеживающими, и синтетический соматотропин с 1982 г. начал производиться в промышленном масштабе.

Еще один гормон, в-эндорфин — опиат мозга, состоящий из 31-й аминокислоты, — был синтезирован в генетически сконструированных клетках кишечной палочки. В 1980 г. австралийский ученый Шайн и американские ученые Феттес, Лэн и Бакстер успешно клонировали ДНК, кодирующую в-эндорфин, в клетках E. ooli и получили этот полипептид в виде слитного белка с ферментом в-галактозидазой. На первом этапе они клонировали фрагмент ДНК, полученный в результате обратной транскрипции и-РНК, кодирующей в-эндорфин, и далее встраивали его в плазмиду E .coli за геном в-галактозидазы, при этом получили гибридный белок, состоящий из в-галактозидазы и в-эндорфина; далее ферментативно отщепляли в-галактозидазу, получая биологически активный в-эндорфин.

Получение интерферонов

Еще одним замечательным достижением генной инженерии является синтез интерферона.

Впервые интерферон был получен в 1957 г. в Национальном институте медицинских исследований вблизи Лондона. Это белок, который выделяется в очень низких количествах клетками животных и человека при попадании в организм вирусов и направлен на борьбу с ними. Первые же исследования выявили высокую биологическую активность интерферона при лечении гриппа, гепатита и даже раковых заболеваний (подавляет размножение аномальных клеток).

Интерферон, как и соматотропин, обладает видовой специфичностью: интерфероны животных неактивны в организме человека и даже отторгаются им.

В организме человека вырабатывается несколько видов интерферонов: лейкоцитарный (а), фибробластный (Р) и иммунный (у) (Т-лимфоцитарный).

Природные интерфероны получают из крови человека с крайне низким выходом: в 1978 г. в Центральной лаборатории здравоохранения в Хельсинки (в то время мировой лидер в получении лейкоцитарного интерферона) из 50-ти тысяч литров крови было получено 0,1 г чистого интерферона.

Процесс получения интерферонов в основных чертах был одинаков для всех типов клеток, выращиваемых в культурах и образующих интерферон. Клетки крови заражали вирусом Сендай и через 24 ч фильтровали на суперцентрифуге. В надосадочной жидкости содержался грубый препарат интерферона, который подвергали хроматографической очистке.

Стоимость препарата была очень велика — 400 г интерферона стоил 2,2 млрд долларов. Однако перспективность фармакологического его использования (в том числе против четырех видов рака) заставляла искать новые пути его получения, в первую очередь с помощью генной инженерии.

В январе 1980 г. был получен интерферон человека в генетически сконструированных клетках кишечной палочки. Исходная трудность при этих методах заключалась в том, что и-РНК интерферонов мало даже в лейкоцитах, стимулированных заражением вирусов, и в том, что выходы были очень низкие: сообщалось о получении 1-2 молекул интерферона на одну бактериальную клетку.

В 1981 г. фирме «Генентек» удалось сконструировать рекомбинантную ДНК, кодирующую у-интерферон, и ввести ее в геном бактерий, дрожжей и даже клетки млекопитающих, и они стали способными синтезировать интерферон с большим выходом — 1 л культуры клеток дрожжей содержал 1 млн единиц интерферона (единица интерферона соответствует такому его количеству, которое защищает 50 % клеток в культуре от заражения вирусом). Процесс был осуществлен следующим образом: исследователи выделили смесь молекул и-РНК из лимфоцитов человека, получили молекулы соответствующих ДНК-копий и ввели их в клетки E. coli. Далее были отобраны бактерии, продуцирующие интерферон.

Получение иммуногенных препаратов и вакцин

Другая область применения генной инженерии связана с получением новых эффективных, безопасных и дешевых вакцин.

Вакцины — одно из самых значительных достижений медицины, их использование к тому же чрезвычайно эффективно с экономической точки зрения. В последние годы разработке вакцин стали уделять особое внимание. Это обусловлено тем, что до настоящего времени не удалось получить высокоэффективные вакцины для предупреждения многих распространенных или опасных инфекционных заболеваний.

Повышенный интерес к вакцинам возник после того, как была установлена роль патогенных микроорганизмов в развитии тех заболеваний, которые ранее не считали инфекционными. Например, гастриты, язва желудка и двенадцатиперстной кишки, злокачественные новообразования печени (вирусы гепатита В и С).

Поэтому в последние 10-15 лет правительства многих стран стали принимать меры, направленные на интенсивную разработку и производство принципиально новых вакцин.

Используемые сегодня вакцины можно разделить в зависимости от методов их получения на следующие типы:
— живые аттенуированные вакцины;
— инактивированые вакцины;
— вакцины, содержащие очищенные компоненты микроорганизмов (протеины или полисахариды);
— рекомбинантные вакцины, содержащие компоненты микроорганизмов, полученные методом генной инженерии

Технологию рекомбинантных ДНК применяют также для создания живых ослабленных вакцин нового типа, достигая аттенуации путем направленной мутации генов, кодирующих вирулентные протеины возбудителя заболевания. Эту же технологию используют и для получения живых рекомбинантных вакцин, встраивая гены, кодирующие иммуно-генные протеины, в живые непатогенные вирусы или бактерии (векторы), которые и вводят человеку.

Принцип применения ДНК-вакцин заключается в том, что в организм пациента вводят молекулу ДНК, содержащую гены, кодирующие иммуногенные белки патогенного микроорганизма. ДНК-вакцины называют иначе генными или генетическими.

Для получения ДНК-вакцин ген, кодирующий продукцию иммуногенного протеина какого-либо микроорганизма, встраивают в бактериальную плазмиду. Кроме гена, кодирующего вакцинирующий протеин, в плазмиду встраивают генетические элементы, которые необходимы для экспрессии («включения») этого гена в клетках эукариотов, в том числе человека, для обеспечения синтеза белка. Такую плазмиду вводят в культуру бактериальных клеток, чтобы получить большое количество копий.

Затем плазмидную ДНК выделяют из бактерий, очищают от других молекул ДНК и примесей. Очищенная молекула ДНК и служит вакциной. Введение ДНК-вакцины обеспечивает синтез чужеродных протеинов клетками вакцинируемого организма, что приводит к последующей выработке иммунитета против соответствующего возбудителя. При этом плазмиды, содержащие соответствующий ген, не встраиваются в ДНК хромосом человека.

ДНК-вакцины обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными вакцинами:
— способствуют выработке антител к нативной молекуле вирусных протеинов;
— способствуют выработке цитотоксических Т-лимфоцитов;
— могут избирательно воздействовать на различные субпопуляции Т-лимфоцитов;
— способствуют формированию длительного иммунитета;
— устраняют риск инфицирования.

Источник статьи: http://mupvirc.ru/gormony/v-biotehnologii-gormon-rosta-i-chelovecheskiy-insulin-poluchayut-putem/

bezinsulina